结核分枝杆菌L型感染对结核病患者耐药状况的影响

结核分枝杆菌L型感染对结核病患者耐药状况的影响
杨小猛;赵丹;陈倩瑜;秦道新;殷玲丽;杜丽伟
【摘要】目的：分析深圳市罗湖辖区结核病患者分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis, MTB)及其L型( MTB-L)的耐药状况,探讨MTB-L感染对结核病患者耐药状况的影响。

方法收集确诊的960例患者(初治916例,复治44例)痰液标本,对其中涂片染色阳性的468例标本进行培养,并对培养阳性的标本进行异烟肼、链霉素、利福平和乙胺丁醇等四种一线药物药敏试验,比较MTB和MTB-L耐药率的差异。

结果 MTB-L和MTB对四种一线药物的单耐药率、多耐药率和耐多药率均不同；MTB-L初治始耐药率显著高于MTB初治始耐药率(46．7% vs 22．4%, P<0．05)；MTB-L复治耐药率略高于MTB复治耐药率,但差异无统计学意义(46．7% vs 33．3%, P>0．05)。

结论 MTB-L感染可能与结核病患者耐药状况改变和耐药率增高有关,加强MTB-L感染监测和耐药分析是当前结核病防控的重要策略之一。

%Objective To analyze the infection status of mycobacterium tuberculosis ( MTB) and mycobacte-rium tuberculosis L form ( MTB-L) in tuberculosis patients in Luohu district of Shenzhen and to investigate the effect of MTB-L infection on the resistant state in tuberculosis patients. Methods The sputum samples were collected from 960 definite tuberculosis patients (916 initial treatment and 44 re-treatment) and detected by acid-fast staining meth-od. 468 positive sample by smear staining method were cultivated, then the cultivated positive sample were carried out susceptibility test with INH, SM, RFP and EB. The statistical difference of the resistant rates of MTB and MTB-L were analyzed. Results The resistance rates of MTB and MTB-L against INH, SM, RFP and EB were
obviously different. The resistance rate of initial treatment of MTB-L was sharply higher than that of MTB (46. 7% vs 22. 4%, P<0. 05). The resistance rate of re-treatment of MTB-L was slightly higher than that of MTB (46. 7% vs 33. 3%, P>0. 05). Conclusion MTB-L infection might participate in the changed resistant state and heightened resistant rate in tuberculosis patients. MTB-L infection monitoring and resistance analysis are important strategies of current tuber-culosis control.
【期刊名称】《临床肺科杂志》
【年(卷),期】2015(000)003
【总页数】4页(P426-428,429)
【关键词】结核分枝杆菌;结核分枝杆菌L型;药物敏感试验
【作者】杨小猛;赵丹;陈倩瑜;秦道新;殷玲丽;杜丽伟
【作者单位】518019 广东深圳，深圳市罗湖区妇幼保健院;518029 广东深圳，深圳市罗湖区慢性病防治院;518029 广东深圳，深圳市罗湖区慢性病防治
院;518029 广东深圳，深圳市罗湖区慢性病防治院;518029 广东深圳，深圳市罗湖区慢性病防治院;518019 广东深圳，深圳市罗湖区妇幼保健院
【正文语种】中文
Effect of mycobacterium tuberculosis L form infection on drug resistant sta te in tuberculosis patients
YANG
Xiao-
meng,
ZHAO
Dan,
CHEN
Qian-
yu,
QIN
Dao-
xing,
YIN
Ling-
li,
DU
Li-
wei
Luohu
Maternity
and
Child
Care
Hospital,
Shenzhen,
Guangdong 518019, China
【Key words】
mycobacterium tuberculosis; mycobacterium tuberculosis L form; drug sen sitivity test
作者单位：1.518019 广东深圳，深圳市罗湖区妇幼保健院
2.518029 广东深圳，深圳市罗湖区慢性病防治院
结核分枝杆菌L型(Mycobacterium tuberculosis L forms, MTB-L)是一种细胞壁缺陷变异型的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，是MTB抵抗外界环境和赖以生存的重要形式。

MTB-L在体内长期存活，其生物学特性、致病性、药物敏感性等均不同于MTB，易引起疾病过程慢性化，可能是导致结核病缓慢地进展、恶化、复发和耐药的重要原因
[1-3]。

菌阴肺结核患者约占活动性肺结核病的70%，而MTB-L阳性占菌阴肺结核患者的30%，而耐多药结核病患者(Multidrug resistance, MDR-TB)中MTB-L阳性率达50%左右。

既往研究提示MTB-L感染可能与结核病复发和耐药率增高有关，因此本研究拟分析深圳市罗湖辖区结核病患者MTB和MTB-L的耐药状况，探讨MTB-L感染对结核病患者耐药状况的影响。

一、肺结核诊断标准按2005年中华医学会临床诊疗指南结核病分册要求确诊，468例结核涂片染色阳性的痰液标本来自2010年1月至2011年12月深圳市罗湖区慢性病防治院肺科门诊确诊病人，其中男286例，女182例，年龄14~80岁，平均年龄28岁。

二、实验方法
1. 主要试剂与仪器光学显微镜为OLYMPUS-CX31型(日本)，CO
2培养箱为HH.CP-01(160L)型(上海博迅)，隔水式恒温培养箱为GNP-
9270型(上海精宏)。

2. MTB药物敏感试验按中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室的要求进行 [4]。

3. MTB-L药物敏感试验
(1)药敏培养基配制A组分：胰胨3 g，大豆蛋白胨1 g，K
2HPO
4 0.
5 g，NaCl 1 g，胱氨酸0.02 g，氯化血红蛋白结晶50μg / ml，DL-蛋氨酸0.2 g，胆固醇0.
6 g，卵磷脂0.6 g，甘油2 ml，蒸馏水加至100 ml。

调节pH至7.8。

B组分：蔗糖50 g，MgSO
4 7H
2O 1.5 g，琼脂粉2.68 g，加蒸馏水至200 ml。

C组分：新生牛血清
20 ml，胎牛血清15 ml。

A、B两组分高压灭菌后，与C组分于45℃混合，其中一部分加入药物后混均分装试管，每管5 ml制成斜面培养基，浓度分别为异烟肼(INH)10 μg/ml、链霉素(SM)100 μg/ml、利福平(RFP)250 μg/ml、乙胺丁醇(EB)50 μg/ml。

另一部分不加药物分装作为对照管。

(2)菌液制备和接种同MTB药物敏感试验制备菌液，静置片刻，使菌液中的颗粒或菌块沉淀后，用刻度吸管或标准接种环，将1 mg/ml的菌液上清逐步稀释至10
-3 mg/ml。

用灭菌微量加样器准确吸取菌液0.1 ml分别接种于对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。

接种后的培养基置于37℃培养，每两天观察一次，至四周后报告结果。

(3)结果判断用“+”号判断MTB-L耐药程度，菌落生长占培养基斜面1/4者为“+”，1/2者为“2+”，3/4者为“3+”，全斜面者为“4+”；按(表1)判断药敏结果：
三、统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学分析，初治及复治结核病患者治疗期间MTB、MTB-L耐药率比较均采用成组设计的两样本率的卡方检验，
P<0.05为差异有统计学意义。

一、MTB药物敏感试验结果
深圳市罗湖辖区MTB初治耐药率为22.4%，其中单耐药率为：INH 4.7%、
RFP 3.3%、EB 1.7%、SM 5.8%，多耐率为3.4%，耐多药率为3.7%；复治耐药
率为33.3%，其中单耐药率为：INH 5.6%、RFP 5.6% 、SM 5.6%，多耐率
为 5.6%，耐多药率为11.1%。

初治结核病患者治疗2月末结核分枝杆菌耐药率为61.5%，其中单耐药率为：INH 23.1%、RFP 5.1%、EB 12.8%、SM 10.2%，多
耐率为5.1%，耐多药率为5.1%；复治结核病患者治疗2月末结核分枝杆菌耐药
率为40%，其中单耐药率为：INH 20%，多耐率为20%，耐多药率为13.6%。

初治结核病和复治结核病患者治疗3月末分别仅有1例培养阳性，故未列入表中(见表2)。

二、MTB-L药物敏感试验结果
深圳市罗湖辖区MTB-L初治耐药率为46.7%，其中单耐药率为：INH 11.9%、RFP 1.2%、EB 11.0%、SM 2.0%，多耐率为16.3%，耐多药率为4.5%；复治耐药率为46.7%，其中单耐药率为：INH 10.0%、EB 10.0%、SM 3.3%，多耐率为16.7%，耐多药率为6.7%。

初治结核病患者治疗2月末结核分枝杆菌耐药率为46.6%，其中单耐药率为：INH 11.6%、RFP 1.0%、SM 1.9%，多耐率为17.5%，
耐多药率为3.9%；复治结核病患者治疗2月末结核分枝杆菌耐药率为50%，其中单耐药率为：INH 16.7%，EB 16.7%，多耐率为8.3%，耐多药率为8.3%(见表
3)。

初治结核病和复治结核病患者治疗3月末培养均转阴。

三、MTB和MTB-L耐药率比较
深圳市罗湖辖区MTB-L初治始耐药率(46.7%)显著高于MTB初治始耐药率(22.4%)(χ
2= 47.148,
P=0.000<0.05)，MTB-L复治耐药率(46.7%)略高于MTB复治耐药率(33.3%)，但无统计学差异(χ
2=0.823,
P= 0. 364>0.05)；实验结果提示MTB-L感染与耐药严重程度密切相关。

(表4、表5)
近年来结核病发病率在全球呈上升趋势，结核分枝杆菌耐药率也逐年增高，导致结核病疫情控制十分困难
[5]。

近年来研究发现，MTB-L感染与结核病复发关系密切，并且可能与结核病患者耐药状况的严峻形势有关。

既往研究发现，初治无耐药MTB-L阳性率明显低于耐多药肺结核，且随着耐药种类的增多，MTB-L阳性率增高，耐多药MTB-L阳性率显著高于无耐药初治肺结核 [6,7]。

MTB-L培养阳性患者复治或复发率显著高于MTB-L培养阴性患者复治或复发率
[8]。

初治肺结核患者MTB-L阳性率显著低于复治肺结核患者MTB-L阳性率
[9]。

本研究发现，深圳市罗湖辖区MTB-L初治始耐药率显著高于MTB 初治始耐药率，MTB-L复治耐药率略高于MTB复治耐药率；实验结果提示MTB-L感染与耐药严重程度密切相关。

因此，MTB-L感染与结核病复治和耐药率增高有关，MTB-L可能是耐多药结核病患者(MDR-TB)久治不愈的重要原因之一。

2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示MTB初治耐药率42.7%，复治耐药率38.5%
[10]；本研究发现，罗湖辖区MTB初治耐药率为22.4%，复治耐药率为33.3%，两者均较前者低，提示本辖区结核病控制维持在一个良好的水平。

这与本辖区及早发现MTB和MTB-L、制定合理治疗方案、避免或减少单药增加治疗、严格按督导短程化疗(DOTS)要求执行、保证患者对结核病知识有正确的认识、治疗依从性强等多项措施有关。

本研究还发现，RFP和SM对MTB-L的作用效果较好，而INH和EM则较差，实验结果为临床医师选用抗结核病药物提供了依据。

即从结核病患者的标本中分离出MTB-L时，除根据药敏试验结果选用抑制蛋白质合成及用细菌合成的药物外，为防止MTB-L产生，应同时选择作用于细胞壁的抗结核药，以达到彻底消灭病原菌、防止病程迁延化或复发的目的。

MTB-L感染与结核病患者耐药严重程度和复发复治密切相关，因此，对结核病患者同时进行MTB和MTB-L药物敏感试验能够为临床提供更为准确可靠的诊断和治疗依据。

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