铈(Ⅲ)-刚果红-牛血清白蛋白体系共振线性和共振非线性散射光谱研究及应用

铈(Ⅲ)-刚果红-牛血清白蛋白体系共振线性和共振非线性散射
光谱研究及应用
李国强;何家洪;徐强
【摘要】基于铈-刚果红-牛血清白蛋白(Ce(Ⅲ)-CGR-BSA)三元离子缔合物的形成,构建了一种新的检测痕量铈的共振线性及共振非线性散射光谱(RNLS)分析法.研究发现,在pH7.6的NH3-NH4Cl缓冲溶液中,Ce(Ⅲ)能够与刚果红、牛血清白蛋白反应生成粒径更大、疏水性更强的三元离子缔合物,致使体系的共振瑞利散射(RRS)、二级散射(SOS)和倍频散射(FDS)强度迅速增加,其最大散射波长分别位于278、543和390 nm处.通过条件试验确定以0.6 mLpH7.6的NH3-NH4Cl缓冲溶液作为反应介质,0.025 mg/mL刚果红溶液用量为1.8 mL,0.1 mg/mL牛血清白蛋白溶液用量为1.0 mL,反应时间为5 min,且大量存在的常见离子对Ce(Ⅲ)的测定不产生干扰.进一步考察发现,在各自最大散射波长处,3种散射光强度的增强
(△IRRS,△ISOS和△IFDS)与Ce(Ⅲ)在2.0～10.0 μg/mL范围内有良好的线性关系,对Ce(Ⅲ)的检出限(3σ)分别为0.29 (RRS)、0.91 (SOS)和3.54 ng/mL(FDS).同时,还对反应机理和散射光谱增强的原因进行了探讨.方法用于实际水样中铈的测定,相对标准偏差为0.94％～1.2％,测定值与原子吸收光谱法的结果相一致,加标回收率介于96％～102％之间.
【期刊名称】《冶金分析》
【年(卷),期】2016(036)001
【总页数】7页(P45-51)
【关键词】铈;刚果红;牛血清白蛋白;共振瑞利散射;二级散射;倍频散射
【作者】李国强;何家洪;徐强
【作者单位】重庆文理学院材料与化工学院,重庆402160;环境材料与修复技术重庆市重点实验室(重庆文理学院),重庆402160;重庆文理学院材料与化工学院,重庆402160;环境材料与修复技术重庆市重点实验室(重庆文理学院),重庆402160;重庆文理学院材料与化工学院,重庆402160;环境材料与修复技术重庆市重点实验室(重庆文理学院),重庆402160
【正文语种】中文
铈作为地壳中最丰富的稀土元素，在冶金、光学陶瓷、超导材料、引火合金材料、储氢材料等领域扮演着重要的角色[1]。

研究表明，适量的铈对于维持机体正常的代谢活动具有重要作用，但过多摄入铈含量高的食物或制剂时，则会威胁人体健康[2]。

目前，测定铈的方法主要有荧光分析法[3-5]、分光光度法[6-9]、电感耦合等离子体质谱法[10-12]等。

自20世纪90年代以来，共振线性及共振非线性散射(RNLS)技术在生物大分子的组装、识别、超分子排列及众多分析领域展示出了其他方法不可比拟的优越性，该技术不仅广泛用于核酸[13-14]、蛋白质[15-16]等生物大分子的研究与测定，也用于环境中金属离子[17-18]、非金属离子[19]、表面活性剂[20]的分析与检测。

但到目前为止，基于RRS技术测定铈的研究尚未见报道。

本文利用弱碱性条件下，铈能够与刚果红、牛血清白蛋白借静电引力、疏水作用力等形成三元离子缔合物，导致散射信号明显增强，且3种散射强度的增强在一定范围内与铈的质量浓度呈正比，从而构建了一种灵敏、便捷、稳定性强的光散射分析体系以用于痕量铈的测定。

1.1 仪器和试剂
F-7000荧光分光光度计(日本岛津公司)；UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；SZ-97自动三重纯水蒸馏器(深圳市三利化学品有限公司)；pH S-2F型
酸度计(上海雷磁仪器厂)。

铈标准储备溶液：0.1 mg/mL，准确称取0.309 9 g Ce(NO3)3·6H2O，用适量水溶解后转入1 000 mL容量瓶中，定容，摇匀，使用时逐级稀释成所需浓度的标准工作溶液；牛血清白蛋白(BSA)溶液：0.1 mg/mL；刚果红(CGR)溶液：0.025
mg/mL；pH 7.6的NH3-NH4Cl缓冲溶液。

实验所用试剂均为分析纯，水均为三次蒸馏水。

1.2 实验方法
于10 mL比色管中，依次加入0.6 mL pH 7.6的NH3-NH4Cl缓冲溶液、适量的铈标准溶液、1.8 mL刚果红溶液及1.0 mL牛血清白蛋白溶液，稀释至刻度，振
荡摇匀，10 min后采用荧光分光光度计分别以λex=λem (Δλ=0 nm)、λem=2
λex和λem=1/2 λex进行扫描，记录体系的RRS、SOS和FDS光谱；然后在各
自最大散射波长处测定样品和试剂空白的光散射强度IRRS、ISOS、IFDS与I0 RRS、I0 SOS、I0 FDS，并计算ΔI(ΔI=I-I0)。

2.1 RRS光谱
Ce-CGR-BSA体系的RRS光谱如图1所示。

由图1可以看出：在波长220～600 nm范围内，单独存在的CGR、BSA、Ce及其二元体系的共振瑞利散射光谱强度
均很弱，不能用于实际分析；但当Ce与CGR、BSA反应形成三元离子缔合物后，体系的RRS光谱显著增强，其最大散射波长为278 nm。

实验进一步研究了散射
强度与Ce质量浓度的变化关系，结果如图2所示，可见随着体系中Ce质量浓度的增加，最大散射波长处的ΔIRRS 成比例增强，表明上述三元体系可用于Ce的
定量检测。

2.2 SOS和FDS光谱
图3和图4分别为Ce-CGR-BSA体系的二级散射(SOS)和倍频散射(FDS)光谱。

由图3和图4可知：CGR、BSA、Ce、CGR-Ce、CGR-BSA、BSA-Ce的二级散射
和倍频散射光谱均很弱，但当CGR、BSA、Ce反应生成离子缔合物后，粒子体积增大，分子质量增加，导致体系SOS、FDS显著增强，其最大散射峰分别位于543 nm和390 nm。

图5和图6为体系SOS、FDS变化值(ΔISOS，ΔIFDS)与Ce质量浓度之间的关系。

由图5和图6可以看出：在二者最大散射波长处，体系的ΔISOS和ΔIFDS 随Ce质量浓度的增大均呈良好线性关系，这表明SOS法和FDS法也可用于痕量Ce的定量分析。

2.3 反应条件优化
2.3.1 介质选择及pH值
以RRS法为例，分别考察了HAc-NaAc、H3PO4-Na2HPO4、KH2PO4-
K2HPO4、NH3-NH4Cl、KCl-HCl、Britton-Robinson (BR)等缓冲溶液对体系灵敏度和稳定性的影响。

结果显示，体系在NH3-NH4Cl缓冲溶液中的测试效果均优于其他介质，故实验选用NH3-NH4Cl为反应介质对pH值进行了优化考察。

结果发现，随着pH值的升高，体系ΔIRRS 逐渐增大，pH 7.6时体系ΔIRRS达最大值；若pH值继续增大，ΔIRRS反而有所下降。

故实验选择pH 7.6的NH3-NH4Cl缓冲溶液为反应介质，其最佳用量为0.6 mL。

2.3.2 刚果红溶液用量
在Ce质量浓度为5 μg/mL，固定BSA质量浓度不变的条件下，按方法1.2分别加入1.3、1.5、1.7、1.9、2.1、2.3、2.5 mL 0.025 mg/mL刚果红溶液进行条件试验。

结果表明，当溶液中刚果红质量浓度较低时，增大其用量能够促进缔合反应的进行，溶液中分子质点数增多，体系散射强度不断增强；当刚果红溶液用量在1.7～1.9 mL范围内时，体系的ΔIRRS信号最佳且稳定；但继续增大刚果红的用量，可能发生了染料的自聚集作用，产生了多聚体，造成体系散射强度减弱[21]。

故为使缔合反应更加充分，且尽可能减少刚果红的自聚作用对测定结果的影响，实验选定刚果红的最佳用量为1.8 mL。

2.3.3 牛血清白蛋白溶液用量
在pH 7.6 NH3-NH4Cl的反应介质中，固定Ce质量浓度为5 μg/mL，CGR质量浓度为4.5 μg/mL的条件下，考察了0.1 mg/mL BSA溶液用量对Ce-CGR-BSA 体系RRS强度的影响。

结果表明，随着BSA溶液用量的增加，体系散射强度逐渐增强；当其用量在0.9～1.1 mL范围内时，体系的ΔIRRS信号最佳且稳定；但继
续增大其用量，体系散射强度值反而有所减小。

故本实验选取BSA溶液的用量为
1.0 mL。

2.3.4 温度的影响及稳定性
实验过程中，将配制好的待测液分别置于5、15、25、30、45 ℃的超级恒温器中恒温30 min后，快速测定体系的RRS强度。

结果表明，当反应温度低于25 ℃时，升高温度有助于增大缔合反应速率，体系散射强度显著增强；但当反应温度高于
25 ℃时，可能因为溶液中粒子的热运动加剧，超过了静电引力和疏水性作用力对
它们的束缚，致使形成的缔合微粒部分解离，溶液中分子质点数减少，造成体系散射强度下降[22]。

故实验选用室温作为反应温度。

此外，进一步对体系的反应速度及稳定性进行了考察，结果发现，5 min后体系的散射强度即可达到最大值，且在5 h内强度基本保持不变。

因此，实验选择反应10 min后进行测试。

2.3.5 离子强度的影响
以加入不同质量浓度的氯化钠溶液考察离子强度对Ce-CGR-BSA体系RRS强度的影响。

结果表明，若NaCl溶液的质量浓度高于0.4 mg/mL，则会造成体系的散
射强度下降。

造成这一现象的原因可能是：离子强度增大，溶液中大量存在的
Na+和Cl-破坏了三元离子缔合物的电荷平衡，导致体系ΔIRRS值减小，反应灵
敏度降低[23]。

同时，也说明了体系中各微粒间的主要作用力为静电引力。

2.4 校准曲线与检出限
最优条件下，按照实验方法1.2测定了不同Ce的ΔI值，并以Ce质量浓度为横坐
标，ΔIRRS、ΔISOS和ΔIFDS为纵坐标绘制校准曲线，曲线的线性回归方程、相
关系数和检出限(3σ)列于表1中。

由表1可以看出：校准曲线的相关系数均大于0.99，可见3种方法都可用于痕量Ce的测定。

2.5 散射增强机理探讨
2.5.1 三元离子缔合物的形成
刚果红作为一种常见的偶氮类染料共振探针，其苯环结构上含有两个亲水性的磺酸基团。

在pH 7.6的NH3-NH4Cl缓冲溶液中，刚果红分子因其磺酸基团解离而以阴离子形式存在。

此时，溶液pH值高于牛血清白蛋白的等电点(PI0=4.7[24])，
导致肽链上的α—COOH及侧链—COOH发生解离，而肽链末端的α—NH2与
侧链—NH2并未质子化，故牛血清白蛋白也以阴离子形式存在。

随着试剂的逐次
加入，带正电荷的三价铈离子可能与带负电荷的刚果红和牛血清白蛋白在静电引力的作用下形成三元离子缔合物，且刚果红苯环上的伯胺还能够与牛血清白蛋白肽链上的氨基酸残基形成氢键，进一步促进三元离子缔合物的形成。

三者之间可能的结合机理如图7所示。

2.5.2 分子体积、相对分子质量增大
反应前，Ce、刚果红、牛血清白蛋白本身的相对分子质量较小，当三者结合形成
粒径更大的三元离子缔合物后，分子体积及相对分子质量会成倍增加。

由共振瑞利散射简式I=KI0MC(式中：I表示散射强度；K表示吸光系数；I0表示入射光强度；M表示相对分子质量；C表示散射分子浓度)[25]可知，当入射光强和溶液中散射
分子浓度固定时，体系的散射强度与缔合物的相对分子质量呈正比，故反应前后相对分子质量及分子体积的增大促进了散射强度的增强。

2.5.3 疏水性增强
实验条件下，单一的Ce、刚果红均能够很好地溶解于溶液中，牛血清白蛋白尽管
具有很大的相对分子质量，但因其带有大量的电荷，可与水形成水合物而未表现出
明显的RRS及RNLS[26]。

当三者相互作用形成电中性三元离子缔合物后，体系的疏水性极大增强。

此外，牛血清白蛋白内疏水性氨基酸残基的裸露也极易引起疏水效应。

因此，结合产物具有更强的疏水性，它们可能与水相之间形成疏水性的“液-固”界面，这种界面增强的散射现象对于散射增强具有重要作用[27]。

2.5.4 共振增强瑞利散射效应
Ce-CGR-BSA体系的主要共振瑞利散射带位于250～450 nm范围内。

从图8可以看出：体系的散射带正好位于吸收带内，最大RRS波长278 nm也恰好位于最大吸收波长附近。

由于共振瑞利散射是一种散射与吸收共同作用的散射—吸收—再散射过程，当体系的瑞利散射带位于或接近于分子吸收带时，瑞利散射频率与吸收频率相等，将产生共振而使RRS强度显著增强[28]。

2.5.5 分子构象对散射强度的影响
文献表明[29]：分子的不同形状及构象会对散射强度产生影响，通常情况下，分子的散射强度随棒状分子、无规则线团、球状分子依次减弱。

反应前，大部分水溶性蛋白是球型的，它们的散射强度较低；但当反应形成三元离子缔合物后，牛血清白蛋白的构象会发生变化(可能形成棒状或无规则线团)，导致体系共振瑞利散射显著增强。

2.6 方法的选择性
按照实验方法，考察了共存物质对5 μg/mL Ce测定的干扰情况。

结果表明，当相对误差不大于±5.0%时，500倍的K+、Na+、Ca2+、SO42-、Cl-，100倍的Ba2+、NH4+、Zn2+、Mg2+、S2O82-，40倍的IO3-、I-，20倍的Mn2+、Ni2+、SCN-及5倍的Pb2+、Ag+、MoO42-等均不会对测定结果产生干扰，表明方法具有较好的选择性。

取适量待测水样，静置，用0.45 μm滤膜抽滤除去悬浮物，加适量HNO3消解完全，用NaOH溶液调节pH值至中性，再次用0.45 μm滤膜抽滤，将滤液转移定
容至100 mL容量瓶中，备用。

按照实验方法测定Ce的含量，同时采用原子吸收光谱法(AAS)进行对照分析，并进行加标回收试验，结果列于表2。

从表2中可以看出：本法测定结果与AAS法测定结果基本一致，相对标准偏差为0.94%～1.2%，加标回收率为96%～102%，说明本法可用于环境水样中痕量Ce的准确测定。

在pH 7.6的NH3-NH4Cl缓冲溶液中，Ce与CGR、BSA络合形成三元离子缔合物，导致体系RRS、SOS、FDS光谱强度显著增强，且3种散射光强度的增强在
各自最大散射波长处与Ce质量浓度呈正比，从而构建了一种简捷、快速、灵敏的测定痕量Ce的散射光谱分析法。

该法用于实际环境水样中痕量Ce的检测，精密
度和正确度考察结果均较好。

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