【推荐下载】化橘红不同粒径粉末粉体特性及体外溶出实验研究

化橘红不同粒径粉末粉体特性及体外溶出实验研究
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 化橘红不同粒径粉末粉体特性及体外溶出实验研究
 作者：刘莉，刘强，吴苗，张宏伟
 【摘要】目的比较化橘红不同粒径粉末的粉体学特性和体外溶出特点，探索超微粉碎技术在中药化橘红中的应用。

方法采用激光粒度分析仪测定粉末粒径;采用生物显微镜观察不同粒径粉末的显微特征;采用固定漏斗法测定休止角;采用高效液相色谱法测定化橘红不同粒径粉末中柚皮苷的体外溶出度。

结果化橘红超微粉碎前后粉末的粉体学特征、有效成分的溶出量差异较大，超微粉中柚皮苷的相对累积溶出率高于普通粉碎所得粉末。

结论化橘红微粉化可使植物药细胞破壁，促进有效成分的溶出。

 【关键词】化橘红;柚皮苷;超微粉碎;溶出度
 Abstract:Objective To compare the powder characteristics and dissolution rate of Exocarpium Citri Grandis in different diameters, and explore the application of ultramicro pulverization technology to E. Citri Grandis.Methods The particle size was detected by laser particle analyzer, and microscopic characteristics were surveyed by the biological microscope. The angle of repose was measured by fixed funnel, and the content of naringin was determined by HPLC.Results Significant differences were observed after micronization in powder characteristics, dissolution rates and concentrations of naringin, which were higher than those in the common powder.Conclution Ultramicro pulverization is helpful for the cell disruption and dissolution of the active components from E. Citri Grandis.
 Key words:Exocarpium Citri Grandis; naringin; micronization; dissolution rate
 超微粉碎技术是近20年发展起来的一项高新技术，尤其应用于中药研究，显现出特有的优势。

植物药有效成分需通过细胞壁才能发挥作用，而超微粉碎可使细胞壁破裂，有效成分直接溶出，从而达到减小用药剂量，提高生物利用度的目的[1，2]。

 化橘红系由芸香科植物化州柚Citrus grandis Tomentosa 或柚Citrus grandis(L.) Osbeck 未成熟或近成熟的果实外果皮干燥而成，功能散寒、燥湿、利气、消痰，主治风寒咳
嗽、喉痒痰多、实积伤酒、呕恶痞闷等证，又名化州橘红、化州陈皮、柚皮橘红等。

化橘红是广东特产药材，以广东化州地区产者为上品，辛香味特别醇厚[3]。

笔者采用超微粉碎机对化橘红进行超微粉碎，并与普通粉碎方法所得化橘红粉末进行了粉体学性质和有效成分溶出的比较研究，为化橘红超微粉碎产业化研究提供理论依据。

 
 1 材料
 1.1 仪器
 FW型高速万能粉碎机(武汉理科光电技术有限公司);BMF?6超微粉碎机(济南倍力粉技术工程有限公司);Nikon Eclipse E600生物显微镜;Nikon Coolpix 4500数码相机;JL9200激光粒度分析仪(济南微纳颗粒技术有限公司);SK1200H超声波提取器(上海科导);RC?6溶出度测定仪器(天津市国铭医药设备有限公司);Agilent 1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司，美国惠普HP 8453紫外检测器);BP110S电子天平(德国)。

 1.2 试药
 化橘红(购自广东广弘药材有限公司，经南方医科大学中医药学院中药鉴定教研室张宏伟教授鉴定为芸香科植物化州柚Citrus grandis Tomentosa 近成熟果实的外果皮);柚皮苷对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号：111702?200607);甲醇为色谱纯，其余
试剂均为分析纯。

 2 方法与结果
 2.1 不同粒径化橘红粉末的制备
 取化橘红药材1 kg，40 ℃干燥，经高速万能粉碎机粉碎，分别过80目、200目、300目(网孔直径45 m)筛，得80～200目、200～300目之间的粉末。

取一部分粉末，再经超微粉碎，分别过300目、400目(网孔直径30 m)筛，得300～400目及400目以下的粉末。

 2.2 粉末粒径的测定和显微特征观察
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 浅谈CpG ODN通过活化p38 MAPK上调A549细胞防御素?2的表达
 作者：李明，陈伟强，李岩，罗少洪，简玲敏
 【摘要】目的研究含CpG基序的寡核苷酸(unmethylated CpG motif containing oligodeoxynucleotide，CpG ODN)对人肺腺上皮细胞A549 防御素?2(human ?defensin 2,hBD?2)的表达及p38 MAPK磷酸化水平的影响。

方法培养A549细胞，加或不加p38特异性抑制剂SB203580情况下用不同浓度CpG ODN进行干预。

用RT?PCR法检测刺激后A549细胞hBD?2 mRNA表达变化，用Western Blot法检测细胞内p38 MAPK蛋白磷酸化水平的变化。

结果CpG ODN刺激可以促进A549细胞内磷酸化p38 MAPK含量的增加，活化p38 MAPK途径，从而诱导hBD?2的表达，与对照组比较,P 0.05;用特异性阻断剂SB203580阻断p38 MAPK磷酸化可抑制CpG ODN的诱导作用。

结论CpG ODN通过p38 MAPK途径诱导hBD?2在呼吸道上皮细胞的表达，增强呼吸道对外界微生物的抵抗作用。

 【关键词】CpG ODN; 防御素?2;肺腺上皮细胞;p38 MAPK
 Abstract:Objective To investigate the effects of unmethylated CpG motif containing oligodeoxynucleotide (CpG ODN) on the expression of human ?defensin 2 (hBD?2) and the phosphorylation of p38 MAPK in lung epithelial cell line A549. Methods A549 cells were stimulated with CpG ODN at different concentrations in the presence or absence of SB203580,an inhibitor of p38 MAPK. The mRNA expression of hBD?2 was determined by RT?PCR and the phosphorylation level of p38 MAPK was detected by Western Blot. Results CpG OND significantly enhanced the expression of hBD?2 in A549 cells. The phosphorylation level of p38 MAPK was markedly up?regulated. CpG ODN?induced hBD?2 expression was suppressed by inhibition of p38 MAPK by SB203580. Conclusion CpG ODN might effectively up?regulate hBD?2 expression in lung epithelial cells through p38 MAPK pathway.
 Key words:CpG ODN;human ?defensin 2;lung epithelial cells;p38 MAPK
 目前认为，呼吸道上皮细胞不仅是物理性的防御屏障，还可以合成和分泌包括抗菌肽在内的多种细胞因子，在气道的炎症反应、免疫调节等方面发挥重要作用。

防御素?2(human ?defensin 2,hBD?2)是呼吸道上皮细胞在细菌和炎症因子诱导下所分泌的主要抗菌肽分子，不仅具有抗菌、抗病毒等生物学活性，还可以激活获得性免疫系统，在呼吸系统抵抗外界致病微生物感染中起重要作用[1]。

如果能增强呼吸道hBD?2的表达，对于防治呼吸系统的感染性疾病和应对日益严重的细菌耐药具有重要意义。

细菌DNA与真核细胞不同，其含有大量的以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cytosine phosphate?guanosine，CpG) 为核心的特定序列(即CpG基序)，因此可被真核细胞通过TLR9识别，最终激活NF? B、p38 MAPK等信号分子启动免疫应答[2,3]。

目前人工合
成的含CpG基序的寡核苷酸序列(unmethylated CpG motif containing oligodeoxynu?cleotide，CpG ODN)已成为一种具有非特异性免疫刺激能力的免疫佐剂，能有效诱导T、B淋巴细胞活化和抗原提呈细胞成熟，增强机体免疫反应。

本研究用CpG ODN刺激肺腺上皮细胞A549，观察其对hBD?2表达的影响，并从p38 MAPK信号途径出发探讨其作用机制，探索CpG ODN作为免疫佐剂对呼吸道天然免疫分子hBD?2的诱导作用。

 1 材料
 1.1 主要试剂CpG ODN 1826、引物(大连Takara公司);两步法RT?PCR试剂盒、Trizol (美国Invitrogen 公司); SB203580(美国Sigma公司);蛋白提取试剂盒、ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司);抗p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK抗体(美国Santa Cruze 公司)。

 1.2 主要仪器PCR仪(美国Perkinelmer公司);紫外凝胶成像系统、蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱(美国Bio?Rad公司)。

 2 方法
 2.1 细胞培养及干预实验人肺腺上皮细胞A549为本室保存，用完全DMEM培养基
传代培养。

生长状态良好的A549细胞经0.25%( )胰酶消化后，调整细胞浓度为5 105/mL，1 mL每孔接种到6孔培养板内，待细胞生长至80%融合后，用PBS清洗2次，更换培养液，加入不同浓度的CpG ODN [4](碱基序列为5 ?TCCATGACGTTCCTGACGTT?3 ，所有碱基均经硫代磷酸化修饰，终质量浓度分别为1,10,50 mg/L),或先加入p38 MAPK特异性抑制剂SB203580(终质量浓度50 mol/L)孵育1 h后再加入CpG ODN进行刺激。

实验分组如下：(1)对照组;(2)CpG ODN 1 mg/L 组;(3)CpG ODN 10 mg/L组;(4)CpG ODN 50 mg/L 组;(5)CpG ODN 50 mg/L+SB203580组。

根据实验要求在相应时间点取细胞进行后继实验。

 2.2 hBD?2 mRNA表达的测定各组细胞加入CpG ODN后继续培养8 h，用Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定A260/A280为1.8～2.0，证实RNA 纯度符合RT?PCR 反应要求。

以总RNA为模板，以Oligo?d(T)18为引物逆转录合成第一链cDNA，用特异性引物扩增hBD?2和? Actin。

hBD?2引物序列如下：Sense：5 ? GCC TCT TCC AGG TGT TTT TG?3 ，Antisense：5 ? GAG ACC ACA GGT GCC AAT TT ?3 ?Actin引物序列如下：Sense：5 ? AGC CTC GCC TTT GCC GA ?3 ，Antisense：5 ? CTG GTG CCT GGG GCG ?3 。

PCR条件为94 ℃预变性4 min，然后94 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共循环30次，最后72 ℃延伸5 min。

1.5%琼脂糖电泳PCR产物，用Qautity One软件分析目的基因与内参?Actin基因的PCR产物灰度值，以二者比值来表示目的基因mRNA的相对表达量。

 2.3 p38 MAPK蛋白磷酸化表达水平的测定A549细胞加入刺激物后继续培养0.5 h，以冰冷的PBS终止刺激，按照试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。

取20 g样品煮沸变性后进行SDS?PAGE电泳(5%的浓缩胶和10%的分离胶)，转
膜，5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加抗p38 MAPK或磷酸化p38 MAPK(1∶1 000)单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液(1∶2 000) 37 ℃孵育1 h，ECL法显影，用磷酸化p38 MAPK与p38 MAPK二者灰度比值来表示磷酸化水平的变化量。

 2.4 统计分析所有数据以( s)表示，采用SPSS 11.0统计软件对实验结果进行Student s t检验分析，P 0.05 为有统计学意义。

 3 结果
 3.1 CpG ODN对hBD?2 表达的影响通过RT?PCR检测发现，在无外源性刺激的情况下肺腺上皮A549细胞hBD?2基因表达极低，用不同浓度的CpG ODN刺激后，hBD?2 mRNA表达亦随之增多，在1～50 mg/L范围内呈剂量依赖性。

而用p38 MAPK 特异性抑制剂SB203580预处理抑制了CpG ODN诱导的hBD?2表达，提示CpG ODN 的诱导作用与其激活p38 MAPK信号途径有关。

见图1。

 A.hBD?2 PCR产物凝胶电泳图; B.hBD?2相对表达量(% of hBD?2/ ?actin); 1. 对照组;
2. CpG ODN 1mg/L组;
3. CpG ODN 10 mg/L组;
4. CpG ODN 50 mg/L组;
 5. SB203580+ CpG ODN 50 mg/L组
 与对照组比较：*P 0.05，**P 0.01
 图1 CpG ODN上调A549细胞hBD?2 mRNA表达
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 取适量药粉样品置于激光粒度分析仪容器内，采用无水乙醇作为分散剂，并将样品进行超声分散，然后测定其粒径。

结果显示，超微粉碎后粉末的D10、D50、D90均显著减小(见表1)。

 将4种粉末分别混悬于水中，超声分散，取此混悬液滴于载玻片上，于生物显微镜下观察粉末显微特征。

结果显示，80～200目和200～300目的粉末颗粒较大，粒径不均匀，并可见原药材的显微特征;300～400目及400目以下粉末粒度明显变小，且大小较为均匀，几无完整的细胞存在(见图1)。

 2.3 休止角( )的测定
 固定漏斗法：将漏斗固定于水平放置的绘图纸上方，漏斗下口距绘图纸高度为H，小心地将微粉倒入漏斗中，直到漏斗下形成的圆锥体的尖端触到漏斗下口为止，圆锥体的直径为2R，休止角( )由公式tg =H/R求出。

 4种化橘红粉末的休止角的测定结果表明化橘红粉末流动性并无太大改变(见表2)。

表1 粉末粒径分析结果表2 休止角( )测定结果
 2.4 化橘红不同粒径粉末中柚皮苷相对累积溶出率的比较研究
 2.4.1 色谱条件与系统适用性试验[5] Thermo Hypersil Gold C18柱(4.6 mm 250 mm,5 以甲醇?醋酸?水(体积比35∶4∶61)为流动相;检测波长为283 nm。

 2.4.2 对照品溶液的制备精密称取柚皮苷对照品0.02000 g，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得对照品储备液。

精密吸取储备液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1 mL含柚皮苷60 g)。

 2.4.3 标准曲线的制备分别精密吸取对照品贮备液0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 mL置10
mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

各精密吸取10 L注入液相色谱仪中，测得峰面积，以对照品质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=1188754X+23.754，r=0.999 9，柚皮苷在0.006～0.096 mg mL-1范围内线性关系良好。

 2.4.4 溶出试验[4] 准确称取不同粒径粉末各3.0 g，进行体外溶出实验(溶出介质：人工胃液，体积为1 000 mL)分别在10、15、20、30、45、60、90、120 min时取样5 mL，取出后补充相应的溶出介质5 mL，溶出条件：转速100 r min-1，温度为37 ℃。

 
 2.4.5 供试品溶液的制备精密量取 2.4.4 项下样品溶液2 mL于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 m)滤过，即得。

 2.4.6 柚皮苷相对累积溶出率测定结果以所测得柚皮苷溶出的最大值对应的浓度做为100%，其他粉末溶出浓度与之相对比，比较不同粒径化橘红粉末中柚皮苷的相对累积溶出率，以相对累积释放百分率为纵坐标，时间为横坐标作图(见图2)，由图可知，不同粒径化橘红粉末柚皮苷在不同时间的相对累积溶出率有明显差异，且粒径越小的粉末柚皮苷越容易溶出。

 3 讨论
 3.1 激光粒度仪测定结果表明，超微粉的D10、D50、D90均显著小于普通粉碎所得粉末，其直径小于细胞的直径，故可认为细胞基本上破壁完全。

显微测定的结果也可以看出：普通粉颗粒大小不均，植物细胞较完整;而超微粉颗粒较均匀，几无完整细胞存在，说明超微粉碎可使植物药的破壁率大大提高。

 3.2 化橘红不同粒径粉末的流动性并无太大改变，这与已有的其他药材超微粉研究的报道结果不同，如在当归[2]、女贞子[6]的研究中均为超微粉流动性变差，笔者也进行过肉桂和川芎的超微粉研究，发现对于含挥发油类的药材，超微粉碎后其流动性均没有太大的改变，这可能与药材本身含有的挥发油诱发的药材黏性有关。

 3.3 溶出实验初始阶段(0～20 min)，粒径小的粉末柚皮苷的溶出反而缓慢，可能与粉末粉碎后短暂的团聚有关，提示在超微粉的储放过程中应注意团聚现象;0.5 h后，超微粉碎粉末有效成分溶出逐渐增加，最终柚皮苷的溶出量大于普通粉碎所得粉末，说明超微粉碎促进了化橘红有效成分的溶出。

 【参考文献】
 [1] 邵林,邵新. 超微粒粉碎技术对部分中药疗效的作用[J].时珍国医国药，2007,18(7):45-47.
 [2] 孙强,何应.当归超微粉的药剂学研究[J]. 中国药房,2007,18(15):1141-1143.
 [3] 莫小路，蔡岳文，曾庆钱.中药化橘红的研究进展[J].食品与药品，2007,9(6):39-41.
 [4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版二部[M].北京：化学工业出版社，2005：附录X C.
 [5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版一部[M].北京：化学工业出版社，2005：51.
 [6] 粘立军，郭旭霞，范文成，等.女贞子超微粉碎前后相关指标的对比研究[J].中国现代中药，2007，9(12)：20-22.
 医药卫生栏目
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