乙型肝炎的病原学诊断
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1 循环= 2 扩增子
2 循环 = 4 扩增子
3 循环 = 8 扩增子
4 循环 = 16 扩增子
5 循环 = 32 扩增子
6 循环 = 64 扩增子
7 循环 = 128 扩增子
循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824(10亿)
未知模板进行定量分析。
Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧 光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold=10×SD cycle0-15
34
Ct值与起始模板的关系
试剂准备室管理制度
1. 实验室人员进入该室须穿专用白色工作服，实验中应需 戴手套。
2. 每天实验开始前，清洁台面并应打开紫外灯消毒30分钟。 3. 取出当天试验需配置和使用试剂，其余试剂要立即收好，
并放回冰箱内。 4. 实验中使用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处理（应
在消毒的有效期内）。 5. PCR其他室的用品不得带入本室。 6. 每次实验记录，应使用本室专用的、带有本室标志的记
14
分离血清
15
加入裂解液提取DNA
16
热裂解
17
高速离心
18
三、实验步骤
（二）HBV－DNA扩增 1、配制反应液（15ul10×TAE，1ulTaq酶，
13ul双蒸水，1ul模板）,振荡混匀. 2、扩增仪中：94℃30秒，55℃30秒，72 ℃1
分钟，共30循环。 3、72 ℃延伸5分钟。
消毒后方可丢弃。 5. PCR产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前
区。 6. 实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。
31
定量PCR概念
以外参或内参为标准，通过对 PCR终产物的分析或PCR过程的 监测，对PCR起始模板量的定量
32
常规PCR与定量PCR的比较
反应方式
反应液成分
结果检测 结果性质 结果准确性
录本、纸和笔。 7. 实验开始后，当天不得再返回本室。
28
29
样品制备室管理制度
1. 实验人员进入该室须穿专用兰色工作服，实验中应需戴 手套，手套须常更换。
2. 样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。 3. 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 4. 实验记录使用本室专用记录本和笔。 5. 使用过的离心管、吸头须置于1％次氯酸钠溶液中浸泡，
46
HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断
目前指标： 1. e抗原阴转 2. HBV 病毒载量小于104拷贝/ml 3. ALT正常 4. e抗体由阴转阳
47
LightCycler
7
48
39
实时荧光定量PCR无需内标
Ct值的重现性:同一模板Ct值恒定. Ct值与起始模板的线性关系决定. 内标对实时荧光定量PCR有影响:加入内标后
PCR反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适 的起始拷贝的内标。
40
定量PCR在临床诊断治疗上的意义
对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷（如HCV） 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 对治疗过程进行药物疗效监测指导用药 加快疾病的诊断，病情判断预后 对染色体突变导致的遗传病进行检测
４２ ＋ ５ １１.９０
２８ ＋ ＋ ＋ ２７ ９６.４３
２９ ＋ ＋ ＋
２９ １００
１０
＋
＋
１０ １００
２８
＋
１ ３.５７
３７
＋
＋
３ ８.１１
１０
＋０
０
１０
＋
＋０
０
────────────────────────────────────
37
Taqman探针原理
但当溶液中有模 板时，模板变性 后低温退火时， 引物与探针同时 与模板结合。在 引物的介导下， 沿模板向前延伸 至探针结合处， 发生链的置换；
38
Taqman探针原理
Taq 酶 的 5'—3’ 外 切 酶 活 性将探针5'端连接的荧光 基团从探针上切割下来， 游离于反应体系中，从 而脱离3’端荧光淬灭基团 的屏蔽，接受光刺激发 出荧光，切割的荧光基 团 数 与 PCR 产 物 的 数 量 成 比 例 。 因 此 根 据 PCR 反应液的荧光强度即可 计算出初始模板的数量。
5
三、实验准备
（一）试剂 1、DNA提取液 2、PCR反应液 3、石蜡油、双蒸水 4、电泳缓冲液（TAE） 5、2％琼酯糖 6、溴化乙锭（EB） 7、Taq聚合酶
10XPCR缓冲液 dNTP 引物
6
三、实验准备
（一）器材和仪器 1、离心机 2、水浴锅 3、PCR扩增仪 4、电泳槽、电泳仪 5、紫外灯 6、移液器
常规 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶 琼脂糖凝胶电泳 定性 无法区别假阴性、假阳 性
定量 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶，探针，参照 ELISA，或实时荧光检测 定量，或定性
有效识别假阴性假阳性
33
实时荧光定量PCR原理
指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号 的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct 值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作 出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值， 及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷 贝数。
35
荧光定量的标准曲线
未知标本 标准曲线
38
log (F2/F1)
log (F2/F1)
Target
例数 HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg HBeAb HBsAb PCR 阳性率(％)
────────────────────────────────────
８６ ＋ ３４ ３９.５３
４５ ＋ ＋ １９ ４２.２２
7
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
移液器
加样枪头
8
高速离心机
旋涡振荡器
9
PCR扩增仪
10
荧光定量PCR扩增仪
11
电泳仪
电泳槽
12
暗室中紫外灯观察结果
13
三、实验步骤
（一）乙肝病毒DNA提取（热裂解法） 1、分离血清 2、50ul血清加入50 ul裂解液混匀。 3、沸水浴煮10分钟。 4、15000转离心15分钟。 5、取上清到另一离心管中备用。
19
三、实验步骤
（三）扩增产物检测 1、配制2％琼酯糖的凝胶 2、取扩增产物10ul加入凝胶小孔中 3、电泳30分钟 4、紫外灯下观察结果。
21
扩增产物分析
22
四、注意事项
1．分区操作：PCR具有超敏感性，因此在 检测过程中应分区操作，即分为样品处理 区，PCR扩增区，产物分析区。
41
定量PCR在乙肝检测中意义
1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播
42
43
44
HBsAg + + + + + -
2、试验前实验室应使用紫外消毒至少30分 钟，实验器械应用70％乙醇擦拭。
3．操作时戴一次性手套，加样头要求及时 更换，吸液时避免飞溅。
23
四、注意事项
4．每天实验前，在废物缸内套上塑料袋， 加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时 将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。
5、EP管在开盖前应离心片刻。 6、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻
-
-
-
HBeAg + +/+ -
-
-
-
抗 HBc -/+ ++ ++/+++ +~+++ +~++ + ++
+~+++
+++
+/++ +/++ -/+
抗 HBc-IgM +++ + + -/+ +~++ +++ -/+
抗 HBe +/+/+/+/-
-
+/-
-
-
-
+/-
+/++
+/-
-/+
+/-
抗 HBs -
分子生物学实验
HBV-DNA检测
一、实验目的
1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法 2、掌握乙肝病毒DNAPCR检测方法
2
二、实验原理
聚合酶链反应（PCR）技术是在体外模拟体 内DNA复制，利用两段特异的寡核酸引物， 由DNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。
3
PCR技术基本原理
4
目的基因扩增
融。 7、每次PCR反应均应设立阴阳性对照。
24
试验实设置与管理
25
PCR室的管理与防污染
PCR室建立严格规章制度 PCR室严格分区 PCR室各区器械专区使用 PCR室各区单向流动 PCR检测前后要用1％次氯酸钠液或75％乙醇擦拭 PCR反应液中使用dUTP防污染
26
27
n
Crossing Point (Cycles)
n
log (copy number)
36
Taqman探针原理
除常规的一对引物以外， PCR反应体系中另加有一个 能与PCR产物杂交的荧光双 标记探针。该探针的5'端标 记一个荧光基团，3'标记另 一个荧光基团。此时5'端荧 光基团吸收能量后将能量转 移给临近的3’端荧光淬灭基 团（发生FRET），因此正 常情况下检测不到该探针5' 端荧光基团发出的荧光信号。
-
-
+ +
临床意义 急性早期 慢性 慢活肝 慢性携带 恢复初期 急性 恢复期，偶为 急性期或慢活 肝，或持续性 少见的综合症 急性进入恢复 期 轻型或无黄疸 型之后转为 HBsAg 低 水 平 携带 既往感染 恢复期早期 恢复期后期， 偶见于慢迁肝 45
ＰＣＲ与乙肝标志物阳性率比较
────────────────────────────────────
消毒后方可丢弃。 6. 患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。 7. PCR扩增后区的物品不得带入本室。 8. 实验完毕后要打开紫外灯消毒。
30
产物分析区管理制度
1. 实验人员进入该室须穿专用红色工作服，实验中应需戴手 套，手套须常更换。
2. 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 3. 实验记录使用本室专用记录本和笔。 4. 使用过的离心管、吸头须置于1％次氯酸钠溶液中浸泡，
2 循环 = 4 扩增子
3 循环 = 8 扩增子
4 循环 = 16 扩增子
5 循环 = 32 扩增子
6 循环 = 64 扩增子
7 循环 = 128 扩增子
循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)
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8
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16
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32
6
64
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1,073,741,824(10亿)
未知模板进行定量分析。
Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧 光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold=10×SD cycle0-15
34
Ct值与起始模板的关系
试剂准备室管理制度
1. 实验室人员进入该室须穿专用白色工作服，实验中应需 戴手套。
2. 每天实验开始前，清洁台面并应打开紫外灯消毒30分钟。 3. 取出当天试验需配置和使用试剂，其余试剂要立即收好，
并放回冰箱内。 4. 实验中使用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处理（应
在消毒的有效期内）。 5. PCR其他室的用品不得带入本室。 6. 每次实验记录，应使用本室专用的、带有本室标志的记
14
分离血清
15
加入裂解液提取DNA
16
热裂解
17
高速离心
18
三、实验步骤
（二）HBV－DNA扩增 1、配制反应液（15ul10×TAE，1ulTaq酶，
13ul双蒸水，1ul模板）,振荡混匀. 2、扩增仪中：94℃30秒，55℃30秒，72 ℃1
分钟，共30循环。 3、72 ℃延伸5分钟。
消毒后方可丢弃。 5. PCR产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前
区。 6. 实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。
31
定量PCR概念
以外参或内参为标准，通过对 PCR终产物的分析或PCR过程的 监测，对PCR起始模板量的定量
32
常规PCR与定量PCR的比较
反应方式
反应液成分
结果检测 结果性质 结果准确性
录本、纸和笔。 7. 实验开始后，当天不得再返回本室。
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29
样品制备室管理制度
1. 实验人员进入该室须穿专用兰色工作服，实验中应需戴 手套，手套须常更换。
2. 样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。 3. 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 4. 实验记录使用本室专用记录本和笔。 5. 使用过的离心管、吸头须置于1％次氯酸钠溶液中浸泡，
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HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断
目前指标： 1. e抗原阴转 2. HBV 病毒载量小于104拷贝/ml 3. ALT正常 4. e抗体由阴转阳
47
LightCycler
7
48
39
实时荧光定量PCR无需内标
Ct值的重现性:同一模板Ct值恒定. Ct值与起始模板的线性关系决定. 内标对实时荧光定量PCR有影响:加入内标后
PCR反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适 的起始拷贝的内标。
40
定量PCR在临床诊断治疗上的意义
对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷（如HCV） 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 对治疗过程进行药物疗效监测指导用药 加快疾病的诊断，病情判断预后 对染色体突变导致的遗传病进行检测
４２ ＋ ５ １１.９０
２８ ＋ ＋ ＋ ２７ ９６.４３
２９ ＋ ＋ ＋
２９ １００
１０
＋
＋
１０ １００
２８
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１ ３.５７
３７
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３ ８.１１
１０
＋０
０
１０
＋
＋０
０
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Taqman探针原理
但当溶液中有模 板时，模板变性 后低温退火时， 引物与探针同时 与模板结合。在 引物的介导下， 沿模板向前延伸 至探针结合处， 发生链的置换；
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Taqman探针原理
Taq 酶 的 5'—3’ 外 切 酶 活 性将探针5'端连接的荧光 基团从探针上切割下来， 游离于反应体系中，从 而脱离3’端荧光淬灭基团 的屏蔽，接受光刺激发 出荧光，切割的荧光基 团 数 与 PCR 产 物 的 数 量 成 比 例 。 因 此 根 据 PCR 反应液的荧光强度即可 计算出初始模板的数量。
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三、实验准备
（一）试剂 1、DNA提取液 2、PCR反应液 3、石蜡油、双蒸水 4、电泳缓冲液（TAE） 5、2％琼酯糖 6、溴化乙锭（EB） 7、Taq聚合酶
10XPCR缓冲液 dNTP 引物
6
三、实验准备
（一）器材和仪器 1、离心机 2、水浴锅 3、PCR扩增仪 4、电泳槽、电泳仪 5、紫外灯 6、移液器
常规 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶 琼脂糖凝胶电泳 定性 无法区别假阴性、假阳 性
定量 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶，探针，参照 ELISA，或实时荧光检测 定量，或定性
有效识别假阴性假阳性
33
实时荧光定量PCR原理
指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号 的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct 值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作 出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值， 及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷 贝数。
35
荧光定量的标准曲线
未知标本 标准曲线
38
log (F2/F1)
log (F2/F1)
Target
例数 HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg HBeAb HBsAb PCR 阳性率(％)
────────────────────────────────────
８６ ＋ ３４ ３９.５３
４５ ＋ ＋ １９ ４２.２２
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
移液器
加样枪头
8
高速离心机
旋涡振荡器
9
PCR扩增仪
10
荧光定量PCR扩增仪
11
电泳仪
电泳槽
12
暗室中紫外灯观察结果
13
三、实验步骤
（一）乙肝病毒DNA提取（热裂解法） 1、分离血清 2、50ul血清加入50 ul裂解液混匀。 3、沸水浴煮10分钟。 4、15000转离心15分钟。 5、取上清到另一离心管中备用。
19
三、实验步骤
（三）扩增产物检测 1、配制2％琼酯糖的凝胶 2、取扩增产物10ul加入凝胶小孔中 3、电泳30分钟 4、紫外灯下观察结果。
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扩增产物分析
22
四、注意事项
1．分区操作：PCR具有超敏感性，因此在 检测过程中应分区操作，即分为样品处理 区，PCR扩增区，产物分析区。
41
定量PCR在乙肝检测中意义
1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播
42
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44
HBsAg + + + + + -
2、试验前实验室应使用紫外消毒至少30分 钟，实验器械应用70％乙醇擦拭。
3．操作时戴一次性手套，加样头要求及时 更换，吸液时避免飞溅。
23
四、注意事项
4．每天实验前，在废物缸内套上塑料袋， 加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时 将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。
5、EP管在开盖前应离心片刻。 6、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻
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HBeAg + +/+ -
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抗 HBc -/+ ++ ++/+++ +~+++ +~++ + ++
+~+++
+++
+/++ +/++ -/+
抗 HBc-IgM +++ + + -/+ +~++ +++ -/+
抗 HBe +/+/+/+/-
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+/-
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+/-
+/++
+/-
-/+
+/-
抗 HBs -
分子生物学实验
HBV-DNA检测
一、实验目的
1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法 2、掌握乙肝病毒DNAPCR检测方法
2
二、实验原理
聚合酶链反应（PCR）技术是在体外模拟体 内DNA复制，利用两段特异的寡核酸引物， 由DNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。
3
PCR技术基本原理
4
目的基因扩增
融。 7、每次PCR反应均应设立阴阳性对照。
24
试验实设置与管理
25
PCR室的管理与防污染
PCR室建立严格规章制度 PCR室严格分区 PCR室各区器械专区使用 PCR室各区单向流动 PCR检测前后要用1％次氯酸钠液或75％乙醇擦拭 PCR反应液中使用dUTP防污染
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n
Crossing Point (Cycles)
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log (copy number)
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Taqman探针原理
除常规的一对引物以外， PCR反应体系中另加有一个 能与PCR产物杂交的荧光双 标记探针。该探针的5'端标 记一个荧光基团，3'标记另 一个荧光基团。此时5'端荧 光基团吸收能量后将能量转 移给临近的3’端荧光淬灭基 团（发生FRET），因此正 常情况下检测不到该探针5' 端荧光基团发出的荧光信号。
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+ +
临床意义 急性早期 慢性 慢活肝 慢性携带 恢复初期 急性 恢复期，偶为 急性期或慢活 肝，或持续性 少见的综合症 急性进入恢复 期 轻型或无黄疸 型之后转为 HBsAg 低 水 平 携带 既往感染 恢复期早期 恢复期后期， 偶见于慢迁肝 45
ＰＣＲ与乙肝标志物阳性率比较
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消毒后方可丢弃。 6. 患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。 7. PCR扩增后区的物品不得带入本室。 8. 实验完毕后要打开紫外灯消毒。
30
产物分析区管理制度
1. 实验人员进入该室须穿专用红色工作服，实验中应需戴手 套，手套须常更换。
2. 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 3. 实验记录使用本室专用记录本和笔。 4. 使用过的离心管、吸头须置于1％次氯酸钠溶液中浸泡，