稳定表达系统和瞬间表达系统的区别

稳定表达系统和瞬间表达系统的区别
稳定表达系统和瞬间表达系统的区别
稳定表达系统和瞬间表达系统是按⽬的蛋⽩表达的时空差异来分的；瞬时表达系统是指宿主细胞在导⼊表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂⽽丢失，⽬的蛋⽩的表达时限短暂。

瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。

⼤规模的瞬时表达技术是近年来的⼀个研究热点。

已有报道能放⼤到100L反应器中⽣产重组蛋⽩，产量可达
1~10mg/L。

缺点是该⽅法技术条件要求⾼，如质粒的纯度、转染的效率等，⽽且瞬时转染得到的蛋⽩质产物保存时间较短，只能持续数天或2周。

这是因为瞬时转染中，外源基因进⼊受体细胞后，存在于游离的载体上，不与基因组染⾊体相整合，当细胞复制后，诱导的性状消失。

稳定表达系统是指载体进⼊宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，可随细胞转录表达和传代，⽬的蛋⽩的表达持久、稳定。

缺点是由于需抗性选择甚⾄加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗⼒。

有研究表明：把⽬的基因定点整合⼊染⾊体⾼活性位点有望能在较短时间内获得⾼表达细胞株。

另外，近年来还报道了⼀些筛选⾼表达克隆的新⽅法，如影印法、固相筛选技术等，对缩短实验时间甚有帮助。

CHO细胞的背景资料
CHO细胞即中国仓⿏卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是⽬前⽣物⼯程上⼴泛使⽤的细胞。

全世界批准正式应⽤于⼈类疾病治疗或疾病预防的基因⼯程产品约有三⼗多种，其中只有⼀种(⼄肝疫苗)是由酵母菌⽣产的，其余所有产品都是由CHO细胞和⼤肠杆菌⽣产的，⼤肠杆菌不能形成有活性的⼆聚体(如⽩介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，⽽CHO却具有如上的功能，因此CHO成为表达复杂⽣物⼤分⼦的理想宿主。

另外CH0细胞在基因⼯程使⽤中还有⼀个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是⼀种⾮分泌型细胞，它本⾝很少分泌CHO 内源蛋⽩，因此对⽬标蛋⽩分离纯化⼯作⼗分有利。

CHO细胞的培养基类型：
1. ⾎清培养
传统上CHO细胞的培养都是在DMEM／F12基础培养基中添加5~10的⼩⽜⾎清(⽤于重组蛋⽩)或胎⽜⾎清(⽤于杂交瘤⽣产)单抗来完成的，⾎清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成DNA，对细胞的增殖有很⼤的作⽤。

实验证明，⾎清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的⽣长因⼦。

但是从重组蛋⽩⽣产的⾓度来看，出于Q和Qc的要求，每换⼀个批号的⾎清，都包含⼤量的验证⼯作，这就给⽣产带来很
⼤的⿇烦。

另外⾎清来源于动物因此经常被污染，污染的⾎清往往导致细胞⽣长缓慢，蛋⽩产量下降，甚⾄导致细胞死亡。

⽬前购⾃各⼤公司的⾎清虽能消灭细菌和所有⽀原体，但很难保证除去所有的病毒污染。

⾎清的成分⼗分复杂，经研究表明，⾎清除含有促进⽣长的活性成分外，还含有⼀定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作⽤，影响细胞功能的表达⾎清复杂的成分也给基因⼯程表达产物的下游⼯作带来很⼤的困难。

培养⽅法：
①把培养瓶内的培养基⽤5ml的移液管转移到保存⽤的离⼼管⾥。

②⽤培养液量的1/2的PBS（25ml‥2.5ml）清洗细胞表⾯（2次）。

③再⽤培养液量的1/10的（25ml‥0.5ml）的胰酶冲洗细胞表⾯
④再CO2培养厢⾥静置5分钟。

（利⽤这段时间，准备好15ml的⼤离⼼管，并也好标签做好记号。

）
⑤物理⽅法处理，（敲击培养瓶两侧）是细胞脱离，再⽤显微镜确认是否完全脱离。

⑥加⼊等倍量的（25ml‥5ml）培养基，充分冲洗培养瓶内表⾯，在连同细胞全部转移到⼤离⼼管中。

⑦离⼼分离（1,000rpm、4℃、10min）。

（这段时间准备新的培养瓶，按照9/10的量（25ml‥4.5ml），加⼊培养液准备好。

加⼊MTX的同时加⼊。

）
⑧离⼼分离后，为了避免沉淀细胞扩散到溶液⾥，要迅速将上清⽤吸管吸除。

⑨加⼊培养液(DMEM+FBS,25ml‥5ml)，⽤移液管充分混匀细胞。

⑩按1/10量，（25ml‥0.5ml）将细胞悬浊液注⼊新培养瓶中。

在CO2培养厢中37度条件下培养。

培养液总量为5ｍｌ
CHO细胞培养：
CHO细胞株置于RPMI1640培养基中，内含10%灭活⼩⽜⾎清，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL，置于37℃，5%CO2的培养箱（德国Heraeus）中培养。

每隔48h换培液，当单层培养细胞汇合以后，⽤0.25%胰蛋⽩酶消化，传代培养。

将培养瓶中的CHO 细胞按1×105/mL传代移⼊培养板中，待进⼊对数⽣长期后（约24h）加药。

2. ⽆⾎清培养
利⽤含⾎清培养基⽣产蛋⽩制品有许多不利，如增加培养成本和污染机会，增加纯化难度和成本，增加产品质控指标。

因此，⼤规模⽣产临床使⽤的⽣物制品，应尽量减
少⾎清的⽤量，最好⽤⽆⾎清培养基取代。

为此，应尽可能增加⼤规模细胞培养的接种密度，以缩短⽣长延滞期，提⾼细胞⽐⽣长速率。

如果接种密度较低时，在培养开始阶段，可使⽤含⾎清培养基，待细胞密度达到⼀定浓度(如>106/ml)，细胞进⼊对数⽣长期，再降低⾎清浓度或使⽤⽆⾎清培养基。

外源蛋⽩的实际产量⽆明显下降。

许多实验表明，细胞的⽐⽣长速度相对降低时，产物的⽐⽣长速率提⾼，原因可能是⽤于细胞增殖的能量减少，有利于外源蛋⽩的⽣产。

使⽤⽆⾎清培养墓代替含⾎清培养基，可克服⾎清带来的弊端。

但失去⾎清中的促细胞⽣长因⼦，细胞⽣长减慢，密度降低，⽣存周期缩短，导致蛋⽩产最下降。

因此，往往通过增加⽆⾎清培养基中的营养物质，以优化细胞培养，提⾼蛋⽩表达。

⽤作⾎清替代成份的种类很多，⼤致可分为激素和⽣长因⼦、结合蛋⽩、贴壁和扩展因⼦及低分⼦量营养因⼦四类。

有研究报道，添加BSA对促进细胞⽣长作⽤显著，丙酮酸钠、腐胺、丁酸钠有利于表达⽬的产物。

不同的CHO⼯程细胞的培养基添加成份可能存在差异，⼀般需要⾃⼰进⾏摸索最优条件。

⼀例⽆⾎清培养试验步骤
1．实验材料
CHO细胞株购于俄罗斯Soym Agromed，⽆⾎清培养基(CHO-S-sFM1I)购于Gibeo公司。

2．实验⽅法
2.1 ⽆⾎清培养基的配制
⽤90ml纯⽔溶解制备1升量的袋装Gibeo CHO-S-sFM1I，加⼈2.45g NaHC03，⽤1N NaOH将pH调为8.0，再⽤1N HC1调回⾄pH7.1，定容后⽤0.22µm滤器过滤除菌。

2.2 CHO细胞的适应
⽤含⾎清的常规培养基和⽆⾎清培养基1:1(v/v)悬浮细胞，接种量为3×105个
/ml。

在37℃，8％培养箱中培养，使细胞密度达5×105个/m1。

然后⽤等体积的CHO-S-sFM1I 将细胞稀释到3x 105个/ml，继续培养，重复上述操作，直⾄⾎清浓度降为0.1％后，⽤完全⽆⾎清培养基培养到3×106个/ml。

再以3×l05个/ml接种，传50代，⾄此完成适应⼯作。

CHO/DHFR-表达系统的特点
CHO表达系统是⽬前应⽤最⼴泛的真核表达系统之⼀，与其它表达系统相⽐，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋⽩在分⼦结构、理化特性和
⽣物学功能⽅⾯最接近天然蛋⽩分⼦；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的⾼效扩增和表达能⼒；贴壁⽣长，有较⾼的耐受剪切⼒和渗透压能⼒，可进⾏悬浮培养或在⽆⾎清培养基中达到⾼密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋⽩，利于外源蛋⽩的分离纯化。

某些利⽤CHO细胞表达的外源基因
⽬前常⽤的CHO细胞包括原始CHO和⼆氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。

CHO-dhfr-细胞⾃⾝缺失⼆氢叶酸还原酶（dhfr），⽆法⾃⾝合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和⽢氨酸
的培养液中才能得以存活。

⽽通过⽬的基因与dhfr基因共转染，不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能⽣长的细胞克隆，更为重要的是由于dhfr可被叶酸类似物MTX 所抑制，在MTX浓度选择压⼒下，dhfr基因必须扩增到很多的拷贝数才能⽣存，从⽽得到抗MTX细胞系；⼜由于与dhfr基因共转染的⽬的基因倾向于同它⼀起整合到细胞染⾊体上的同⼀区域，所以编码外源重组蛋⽩的序列⽚段也随着dhfr基因的扩增⽽扩增，我们就得到了能⼤量表达外源蛋⽩的细胞克隆，这在基因⼯程抗体及各种基因⼯程蛋⽩的表达中是可⾏度很⾼的⼀种措施。

影响重组蛋⽩在CHO细胞中表达的因素很多，涉及CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞⼤规模培养等。

有⼈认为表达载体的构建是影响细胞能否表达的关键问题，因为dhfr基因及邻近区段染⾊体DNA拷贝数是共扩增的关系，因此必须将外源基因⽚段整合到dhfr基因的上游或者下游，位置不能太远，否则⽆论如何筛选也得不到表达外源基因产物的细胞，因此说它是能否表达的关键，当然其它步骤也不能忽略，如CHO-dhfr-细胞转染、使⽤强启动⼦等。

如果构建成功可以产⽣外源蛋⽩，那么筛选⾼表达的细胞株等操作就是提⾼外源蛋⽩表达量的问题，使外源蛋⽩⾼效表达，也是很有意义的，为⼤规模培养奠定基础。

MTX筛选扩增系统，常需在MTX选择压⼒下，经过长期的筛选。

因此MTX加压筛选是需要时间和耐⼼的，但是细胞培养的条件要合适，如培养基的选⽤（CHO细胞⼀般采⽤F-12培养基），营养成分的适量（L-⾕氨酰胺），培养液的新鲜等，⾸先要保证细胞正常的⽣长和存活，这样才能缩短加压筛选的周期。

另外也要等细胞适应这个压⼒并恢复正常⽣长后再继续加压，提⾼MTX浓度，可以成倍数递增，待细胞适应新的压⼒并恢复正常⽣长时再继续，同时还要保存每个MTX浓度下的细胞种⼦。

因为在此后的细胞培养的过程中，随着MTX的撤离和细胞传代次数的增加，转染细胞⾼表达抗体的能⼒常会逐渐下降甚⾄丧失。

因此，即使是来源于同⼀细胞株的各个亚克隆细胞之间，其抗体表达量也常不均⼀。

CHO转染细胞的这种不稳定性，可能是由于细胞内外源基因拷贝数的丢失或转录效率下降等所致。

对此尚有待进⾏深⼊地研究。

但这⼀现象提⽰，在筛选建株的早期，应采取措施及早鉴定各个细胞克隆表达的稳定性，并及时⼤量保存稳定⾼表达的细胞种⼦，或适时地对细胞株⽤MTX 再加压和克隆化筛选，以保持转染细胞⾼表达抗体的能⼒。

应及时⽤MTX对细胞株进⾏再加压筛选，以保持细胞稳定表达抗体的能⼒。

有报道称加压⽅式对表达量的提⾼和细胞株表达的稳定性有较⼤的影响。

⼩梯度多次加压有利于最终得到⾼表达细胞株，且细胞株表达稳定，⽐⼤幅度快速加压能够得到表达⽔平更⾼的克隆。

⼤幅度加压可以在短期内得到⾼表达克隆株细胞，但是最终表达
⽔平并不⽐⼩幅度多次加压得到的细胞株表达量⾼，⽽且细胞株表达往往不稳定，在撤掉筛选压⼒后，表达⽔平往往下降。

在⼤幅度加压筛选过程中，可能由于种种原因dhfr基因发⽣突变，突变后的DHFR对MTX的亲和⼒降低，因⽽突变细胞株的基因
扩增倍数也低，⽬的基因⽆法⾼表达，更易产⽣⾮⽣产性克隆。