生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用

生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用
朱善元
(江苏省畜牧兽医学校,江苏泰州225300)
关键词:PCR;引物;DNA聚合酶;微生物检测
摘　要:简述生物检测新技术PCR的原理、特征,及其在兽医微生物检测中的应用。

归纳和小结了其在临床传染病诊断中的应用领域,对从事畜禽疾病诊断、防治的工作人员进一步掌握和运用PCR技术具有一定的指导意义。

中图分类号:S813.3 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(1999)11-0021-02
PCR聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)也称无细胞分子克隆系统,是1985年由美国的K ary Mullis等人首创并由美国G etus公司开发的一项专利,应用该方法可使极微量的特定DNA片断在几小时内迅速扩增到百万倍。

具有特异性强,灵敏度高和快速准确的优点,因而发展迅速,应用范围越来越广泛,不仅可用于基因表达调控,基因克隆与测序,制备特异探针,特异基因筛选等基础研究,而且在医学、农业科学、食品科学、环境科学及考古学等领域得到了广泛的应用。

本文着重介绍其作为一项最新的生物检测技术并简述其在兽医微生物检测的应用。

1　PCR技术的基本原理
根据已知的待扩增的DNA片段序列、人工合成与该DNA 两条链末端互补的两段寡核苷酸引物,在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增,这种方法也就是PCR技术。

PCR全过程可分为DNA模板变性、退火、延伸三个连续步骤,经若干个循环所组成。

首先高温作用使模板DNA变性解链,然后降低温度使人工合成的两个寡核苷酸引物与模板DNA 链3′端退火,在Taq DNA聚合酶作用下,有4种dN TP底物存在时,引物链将沿着5′～3′方向延伸与模板互补的新链,新链则可作为下一次反应的模板,由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。

通常单一拷贝的基因经25～30循环可扩增100万～200万拷贝。

2　PCR技术的特征和要求
完成PCR反应的组成物质主要有引物、dN TPs、DNA聚合酶(Tag酶)、缓冲液、Mg++及核酸模板等,其基本特征和要求介绍如下。

2.1　引物
引物是与待扩增DNA片断两侧互补的寡核苷酸,是决定PCR扩增特异性的关键因素,引物设计与合成的好坏直接决定PCR扩增的成效。

通常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区域,长度为15～30碱基为宜,引物内的每种碱基不能有太多的连续重复,引物间的Tm值应尽可能接近,GC含量不能太高。

2.2　dN TPs
dN TPs是PCR反应所必须的底物,为四种核苷酸的混合物。

当四种核苷酸的错误掺入率降至最低,最适宜的dN TPs 终浓度应根据被扩增片断的长度和碱基组成来确定。

一般使用的浓度为0.2mol/L。

2.3　DNA聚合物
收稿日期:1999-05-10
作者简介:朱善元(1968-),男,江苏人,讲师,大学本科.
目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TagDNA,它是由水生栖热菌产生,热稳定性好。

它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响,一般在100μL反应体系中用2单位,另外近年来还使用耐热的PfuDNA聚合酶和r TthDNA聚合酶,nTthDNA聚合酶可由其将RNA反转录后扩增出大量的DNA片断,大大减化操作程序,提高了效率。

2.4　缓冲液
PCR常用的缓冲液是10～50mmol/L的Tris-HCl (p H8.3～8.8)体系,注意不能把不同厂家的Tag酶与缓冲液交叉使用。

2.5　Mg++
Mg++是TagDNA聚合酶的激活剂,其浓度高低明显影响PCR产物的特异性和产量。

一般选用2～5mmol/L的浓度。

2.6　核酸模板
以细菌为例,作为模板的可以是染色体DNA,也可是质粒DNA,通常PCR反应体系中所需的模板的量是102～105拷贝的靶序列。

3　PCR技术在兽医微生物检测中的应用
PCR技术在兽医临床上可作为传染病的确认和分析的新技术,简便、快速、准确。

传统检测微生物的步骤繁琐,且具有一定的局限性,首先对样品进行被检测微生物的富集培养,当其数量在样品中达到可检测水平后才能进行微生物的分离,形态特征观察及生理生化鉴定。

此外,传统的方法难以对那些人工难以培养的微生物进行检测。

而PCR技术克服了这一缺点。

由于不同微生物组成的核酸不同,根据PCR技术的原理和方法,只需要在特定的核苷酸引物,4种三磷酸核苷酸及多聚酶等的作用下,就可以确认和分析微生物种类。

这在兽医临床上具有广泛的应用意义。

PCR检测细菌的方法和应用,由于在所有细菌中编码rRNA的一些基因保守性很强,因此,可以用PCR扩增其相应的DNA片段,首先要抽提靶DNA,通过离心或过滤的方法从样品中获得细菌细胞,然后将细胞裂解,进行核酸纯化,使其适合作PCR。

也可以直接裂解样品中细菌细胞,抽提核酸。

例在大肠杆菌检测中的应用,传统的检测方法是将细菌和要检测的能利用乳糖的革兰阴性菌一起培养,检测方法繁琐,需花费几天的时间,若根据大肠杆菌类能够利用β-半乳糖苷酶,采用明确的底物进行检测,虽可以加速检测到大肠杆菌类,但对一些并不表达β-葡萄糖醛酸苷酶的大肠杆菌品系,则无法检测到大肠杆菌。

若利用PCR技术可为检测β-半乳糖苷酶(lac)和β-葡萄糖醛酸苷酶(uid)基因提供了一个灵敏度高、特异性强的方法,通过PCR扩增lacZ和uidA基因,即可分别检测出大肠杆菌类和大肠杆菌。

RT-PCR检测病毒的方法和应用,首先要进行病毒的鸡
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生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用-朱善元
胚接种,然后取鸡胚尿囊液(病毒的培养液),提纯RNA,并制备cDNA,接着进行PCR,再鸡胚接种后即可获得大量的可克隆的双股RNA片段。

例用RT-PCR技术检测鸡流感病毒,鸡流感病毒在我国部分地区经常流行,且种类很多,目前尚无有效的办法预防,因而增强检测的准确性非常重要,一般采用将接种后24h收获的鸡流感病毒鸡胚尿囊液,提纯RNA并制备cDNA,应用2个包含有预先合成的限制酶切位点的引物进行PCR,鸡胚接种后36h即可获得大量可克隆的鸡流感病毒双股RNA片段,这是一种典型的RT-PCR技术,是一种高效快速检测鸡流感病毒的方法。

当然,利用其他种类的PCR技术也可检测病毒,方法不再赘述。

总之,PCR技术的出现对微生物检测,只是把许多试剂放在一个试管内进行液相杂交,因而既灵敏又快速,可作快速诊断的方法,标本经PCR法后作凝胶电泳,凝胶板经溴化吡啶染色后紫外线下可见特异性条带,可免去分子杂交中应用同位素,并且PCR技术自动化程度日益提高,促进了PCR成为诊断和监测畜禽传染病的常规技术。

(009)
仔猪下痢的病因分析与综合防制
马保全1,张守明2,邓光华2,宋小洪1
(1.安阳市畜牧示范场,河南安阳454900;2.安阳市畜禽疫病防治站)
中图分类号:S858.52 文献标识码:B 文章编号:1004-7034(1999)11-0022-02
仔猪下痢是仔猪吮乳期和断奶期间最为常见的疾病之一,各种日龄仔猪均可发生,一般多发生于生后1～3日龄、7～14日龄和仔猪断奶的一段时间内3个阶段,导致成活率低,增重差,饲料转化率下降,直接影响着养猪者的经济效益。

笔者通过多年来的生产管理实践和临床防治效果观察,对本病的发生有了一定的认识,采取综合防制措施,收到了较好的效果。

现总结报告如下。

1　病因分析
仔猪下痢主要是由于环境污染,产房卫生条件差,消毒不严格,环境中的病原微生物污染了母猪的乳头,初生仔猪吮乳时,病原微生物进入了仔猪的消化道,引起肠道卡他性炎症。

肠道内容物发酵与腐败后产生大量气体,增加了对肠道的刺激,使肠道蠕动加剧,造成吸收功能障碍。

主要由魏氏梭菌及大肠杆菌等病原微生物引起。

妊娠母猪饲养管理不当,妊娠后期过肥或过瘦,所生仔猪瘦弱,初生重过低,抵抗力低下,易引起下痢。

临产及哺乳母猪饲养管理不当,饲料更换突然,日粮增减不科学,使母猪泌乳受到影响,引发哺乳仔猪胃肠道消化吸收功能紊乱,导致仔猪下痢。

哺乳母猪患病后,往往引起体温升高,生理代谢紊乱,引起乳汁变性,致使仔猪消化不良,致病性大肠肝菌等病原微生物乘虚而入,大量繁殖,导致仔猪肠道发生炎症,出现下痢。

肠道内病原微生物繁殖产生内毒素被吸收,出现仔猪吸吮呕吐;空肠分泌大量粘液,造成仔猪脱水。

该病以产后1周发病最多,严重时死亡率高达70%以上。

仔猪未吮足初乳,未能从初乳中获得足够的母源抗体;仔猪缺铁导致的营养性贫血和缺硒引起的下痢;仔猪补料方法不当导致消化不良而引发下痢;仔猪食欲旺盛,若供水不足或不洁,可导致误饮尿液污水,致使细菌感染,发生细菌性下痢;环境刺激,气候骤变,阴雨潮湿,防寒保暖措施不利,仔猪受凉,抵抗力下降,可由数种不同血清型致病性大肠杆菌引起仔猪下痢。

饲料管理不当,仔猪饲料中饼粕类含量过多、饲料霉变、麸皮比例过大,喂给青绿料过多等。

饲料中饼粕类含量要适中,如果比例过高,仔猪的消化机能不健全,采食后消化不良而下
收稿日期:1999-08-23
作者简介:马保全(1964-),男,河南安阳人,中级畜牧师,大专.痢;霉变饲料含有大量毒素,可导致仔猪消化机能紊乱发生下痢;饲料中麸皮比例过大,或喂给青绿饲料过多,致使仔猪难以完全吸收利用,也可导致下痢。

2　综合防制
2.1　加强饲养管理
2.1.1　保持产仔母猪及其栏舍的清洁卫生,定期严格消毒,每天至少清理粪尿1次,消毒1～2次,尽量减少母、仔猪饲养环境中的病原微生物。

每批仔猪转出以后,应对猪舍门窗、墙壁、地面、产床等先用水冲刷干净,再用2.0%的火碱液喷洒消毒,以喷湿为宜;母猪转入产房前,应将其身上的粪污冲刷干净,再用0.5%的高锰酸钾液或用百毒杀、易克林等对猪体喷洒消毒;母猪临产时,接产人员应用0.1%的高锰酸钾液擦拭乳头、乳房及阴户周围,接产用具必须干净卫生。

2.1.2　创造母仔适宜的生存环境,做好防暑保温工作。

炎热夏季应加强通风和降温,防止母猪中暑,保持母猪旺盛的食欲,从而保证母猪正常泌乳;冬季应采取保温措施,做到大环境母猪适宜,小环境仔猪舒服。

产房可采用煤火或暖气升温,温度保持在18℃左右;仔猪应采用护仔箱、电热板、远红外线灯泡等使产后1周内局部温度保持在30℃左右,1周后逐渐降温,使仔猪适应产房温度。

另外还须加强设备和电路维修,保证正常取暖;提高饲管人员责任心,保证夜间、特别是后半夜产房温度;注意天气变化,在大风降温天气来临前,积极采取有效措施升温、保温。

适宜的温度将大大降低仔猪下痢发病率。

2.1.3　加强妊娠母猪的饲养管理,妊娠后期每日给料可由妊娠中期的2.0kg左右增加到
3.5kg左右,临产前1周开始,每日减少给料0.5kg。

同时应适当提高妊娠后期的营养水平,以达到母壮仔肥的目的。

实践证明,充足的维生素、平衡的氨基酸、稳定的饲料配比,可大大提高仔猪的初生重和生活力,以充分适应外部新环境。

2.1.4　加强泌乳母猪的饲养管理,充分发挥其泌乳性能。

产仔当天不给料,只给麸皮淡盐水,第2天开始给料0.5～1.0kg,以后每天给料增加1.0kg,1周后达到自由采食水平。

不要一次给料过多或每日给料增加过快,引起母猪消化吸收功能紊乱,泌乳受到影响,导致仔猪生病、下痢。

2.1.5　母猪产后应用0.1%高锰酸钾液擦拭乳头及乳房,并挤掉每个奶头的头两把奶,然后辅助初生仔猪尽早吃好初乳,这是防止母猪乳房炎和仔猪下痢的重要措施。

22黑龙江畜牧兽医1999年第11期。