细胞生物学实验手册：染色体扫描电镜标本制备及观察

实验二十二染色体扫描电镜标本制备及观察
【实验目的】
了解扫描电镜观察染色体的方法及标本制备过程。

【实验用品】
一、材料和标本光镜观察过的染色体标本片。

二、器材和仪器 S一450扫描电镜、IB一3离子镀膜机。

三、试剂 2.5％戊二醛、0.1mol／L(pH7.4)PBS、l％锇酸、2％单宁酸、30％、50％、70％、80％、90％、100％乙醇溶液。

【实验内容】
一、原理
扫描电镜用于观察标本的表面形态。

用戊二醛和锇酸处理的染色体标本，经单宁酸(或硫卡巴肼)还原可获得较好的导电染色效果。

在扫描电镜下可观察到染色体的三维结构，也可用于常规染色体核型、G带染色体核型、高分辨染色体核型的分析及染色体结构异常识别，以弥补光镜的许多不足。

在扫描电镜下还可清楚地观察到肿瘤细胞癌基因扩增结构—双微体。

因而此方法广泛用于细胞生物学和遗传学的许多研究。

二、染色体标本制备的方法
1．常规染色体标本制备，同实验十。

2．取一张在光镜下观察过的染色体标本片选择分散良好的分裂相，并在背面做出标记以便电镜观察时易于寻找。

3．3:1甲醇一冰乙酸脱色，用磷酸缓冲液洗。

4．2.5％戊二醛固定30分钟。

5．0.1mol／L(pH7.4)PBS漂洗3次。

6．1％锇酸固定5分钟。

7．蒸馏水洗3次。

8．2％单宁酸处理5分钟。

9．蒸馏水洗3次。

10．1％锇酸处理lO分钟。

11．水洗3次。

12．30％→100％乙醇逐级脱水，每级5分钟。

13．临界点干燥(也可用空气干燥)。

14．把标本片标记的核型所在处用玻璃切下约5×5mm2，用导电胶固定在标本台上。

15．离子镀膜(也可不镀膜直接观察)。

16．扫描电镜观察、照相。

三、染色体形态观察
低倍观察可见染色体的不同分裂相，在分散较好的分裂相中，染色体呈三维立体形态。

高倍观察染色体呈长短不等的园柱状，两条单体由着丝粒相连，其表面凹凸不平，沿纵轴有许多环形沟把染色体分成许多节段。

可见染色体表面由许多细纤维构成。