红花低分子量油体蛋白基因的克隆与系统进化分析

红花 （ Ｃ ａ ｒ ｔ ｈ ａ ｍｕ ｓ ｔ ｉ ｎ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｕ ｓ Ｌ． ）为 菊科 红 花 属 取 野 生 型 红 花 种 子 置 于 液 氮 中 ，利 用 Ｒ ＮＡｉ ｓ ｏ 的植 物 ，含 油 率 高 、产 量 也 高 ， 因此 成 为 新 兴 的 Ｐ ｌ ｕ ｓ（ 大 连 宝 生 物 工 程 有 限公 司 ）提 取 红 花 种 子
１ 材料 与方法
１ ． １ 种子与植株
野生红花种子， 来源于新疆塔城， 本实验室保存。 １ ． ２ 试 剂 Ｒ ＮＡ提 取试 剂 盒 ，Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ 试 剂 盒 ，Ｔ 载体 试 剂 盒 ，Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ 连接酶 ，核酸 内切酶等 为大连宝生物 公 司产品；其他试剂均为国产分析纯产品。
ＣＡＴＴ ＡＴ 一 ３’
参 照Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ 试 剂盒 说 明书 ，将 提取 的红 花种 子 总Ｒ ＮＡ反 转 录 为 ｃ Ｄ ＮＡ。 经优 化 后 的Ｐ ＣＲ 扩 增 程 序 为 ：９ ４ ℃ ，４ ０ Ｓ ，５ ５ ｏ Ｃ，４ ０ Ｓ ，７ ２ ｏ Ｃ ５ ０ Ｓ ，共 ３ ０ 个 循 环 ，最后 ７ ２ 再 延伸 ６ ｍｉ ｎ 。 １ ． ５红花Ｌ — Ｏ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ 基 因测 序与 系统发生分 析 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 的 目的 基 因产 物 回收并 纯 化 之 后 ，克 隆 人 ｐ ＭＤ１ ８ 一 Ｔ 载体 中。 酶切 鉴定 阳性 的克 隆委 托上 海 英 骏测 序公 司 （ Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ） 进 行 测序 。 获 得测 序 结果 之后 ，检 索ＮＣ Ｂ Ｉ 数 据库 已公
（ 长春 师范大 学 生命科 学 学院 ，吉林 长 春 １ ３ ０ ０ ３ ２ ）
摘
要 目的：克隆红花低 分子量 油体蛋 白基 因Ｌ ． Ｏ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ ，并进行测序和序列 比较分析。方法 ：参考 已完成的红花 转录组测序
结果 ，设计特异性 引物 ，从野生型红花种子 中提取Ｒ ＮＡ，以 Ｒ １ １ － Ｐ Ｃ Ｒ方法扩增Ｌ ． Ｏｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ 全长基 因，测序之后 ，进行 不同物种 同 源基 因间的 系统发生分析 ，应 ） ￣ Ｐ ｈ ｙ ｌ ｉ ｐ 软件绘制分子进化树。 结果：克隆了红花低 分子量油体蛋 白基 因，系统发生分析表 明 ，
ห้องสมุดไป่ตู้
油料作物 ，其含亚油酸高达７ ０ ％ ８ ０ ％…。红花种 子油在 医药上常用作抗 氧化剂 和维 生素Ａ和Ｄ 的稳 定剂［ ２ 】 。用 红 花 油 体 系统 作 为 生 物 反应 器 生 产 药 用 蛋 白具有生产成本低 、易于分离纯化 、提高农业生 产 附加值 等优 点 【 ３ 】 。 Ｏｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ 是 与 油 体 特 异 性 结 合 的 一 种 碱 性 蛋 白 质 ，也是油体 中发现最早且含量最高的蛋 白质 ，只 存 在 于植 物 中［ ４ ］ 。Ｏｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ 在被 子 植 物 主要 存 在 高 分 子量 和低分子量两种 同型体 ［ ５ 】 ，为 了探索油体蛋 白 与红 花 含 油量 的关 系 ，便 于利 用基 因 工程 改 造提 高 红花 的含油量 ，以及利用油体表达系统表达外源蛋 白 ，本研 究 通 过提 取 野生 红 花种 子 ￣ ， Ｒ ＮＡ，反 转 录 成ｃ ＤＮＡ之 后 ，设 计 特 异 引 物 克 隆 了 红花 低 分 子 量 （ Ｌ — Ｏ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ） 油体蛋 白基 因，测序之后 ，进行了系 统发生分析 ，为后续研究奠定基础。
１ ． ３ 红花种子总ＲＮ Ａ 提取
收稿 日期 ：２ ０ １ ４ － １ ２ － １ ８
开资料 ，以Ｂ Ｌ ＡＳ Ｔ 检索 比对Ｌ ． Ｏｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ 基 因在不 同 物 种 间 的 全 长 编 码 序 列 ，下 载 处 理 之 后 ，利 用 ｐ ｈ ｙ ｌ ｉ ｐ 软件 （ ３ ． ６ ９ ５）采 取邻 接 分 析 的最 大 似 然距 离 （ Ｍａ ｘ ｉ ｍ ｕ ｍ Ｌ ｉ ｋ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｏ ｄ ，ＭＬ） 法建立系统进化树 ， 进 而 分析 红花 Ｌ — Ｏ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ 基 因 的系统 进化关 系 。
Ｌ — Ｏｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ ￣ 因的 变异很 大，物种 间差异明显。 结论 进行 油体蛋 白基 因相 关功能研 究和建立油体 蛋 白表 达 系统等方面的研 究应
该 以同种属植物或 亲缘关 系较 近的植物之间应用为主，基 因工程 改造和功能验证应在本物种上进行 ，然后拓展至近缘 物种 。 关键词 红花油体蛋 白；基 因克 隆；系统发 生分析 中图分类号 ：Ｒ ２ ８ ４ ． ２；Ｒ ２ ８ ５ 文献标志码 ：Ａ 文章编 号 ：１ ６ ７ ３ — ８ ９ ０ Ｘ（ ２ ０ １ ５） ０ ３ — ０ ０ １ — ０ ２
引 物序 列设 计 参 考 课题 组 红 花 种子 转 录 组测 序 结 果 的参 考序 列设 计如 下 ：
Ｆ ｏ ｌ 上游 ５ ’一 ＣＣ Ｃ Ｔ Ｔ ＣＡ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ ＡＣ Ｃ Ｔ
ＴＣＴＴＣＣ 一 ３’
Ｒ ｏ ｌ 下游 ５ ’一 ＡＡＣ ＧＧ ＡＧ ＣＣ Ｔ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ ＡＣ Ａ Ｔ Ｔ
第９ 卷第 ３ 期
Ｖ０ １ ． ９ Ｎｏ ． ３
南方 农业
Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ Ｃｈ ｉ ｎ ａ Ａ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ
２ ０ １ ５ 年１ 月
Ｊ ａ ｎ ． ２ ｏ】 ５
红花低 分子 量油体蛋 白基 因 的克 隆 与系统进 化分析
候 文静 ，王 旺，方 锐 ，沃 思宇 ，张 捷 ，丁亦男
Ｒ Ｎ Ａ，按照反转 录试剂盒操 作说 明将 其反转 录成 ｃ Ｄ Ｎ Ａ，作为Ｐ Ｃ Ｒ 模板 ，应用 自行设计的Ｏ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ 基 因特 异 性 引物 建 立 反应 条 件进 行 目的基 因克 隆 ，提 取的 ． ８ ０ 冰箱保存备用。
１ ． ４ 红花Ｌ — Ｏｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｎ 基 因Ｐ ＣＲ 扩增 的 引物设 计