重症医学科患者主动筛查分离的耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药基因及遗传标记检测

重症医学科患者主动筛查分离的耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药
基因及遗传标记检测
杨雅芸;陈琳;许小敏;梁珊燕;王春萍
【摘要】目的了解宁波地区6家三级医院成人ICU患者主动筛查分离的耐药鲍曼不动杆菌中获得性耐药基因与可移动遗传元件的存在状况.方法采用主动筛查ICU 患者收集菌株,聚合酶链反应(PCR)及序列分析检测获得性耐药基因与可移动遗传元件,GN-16药敏卡及K-B法测定药物的敏感性.结果 40株不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率27.5％,替加环素耐药率25.0％,其他常见抗菌药物耐药率均为100％.检出β-内酰胺酶TEM、ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-24、OXA-66等6种基因,ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-66检出率均达100.0％.检出氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3')-Ⅰ和armA 16SrRNA 甲基化酶基因,阳性率均低于25.0％.可移动遗传元件遗传标记中IS26、ISaba1检出率均达100.0％.intⅠ 1、tnpU检出率均为25.0％.连锁检测ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23阳性率均为100.0％,而ISaba1-OXA-66均呈阴性.获得性耐药基因OXA-2群、OXA-23、OXA-66及ADC与MGEs遗传标记IS26、ISaba1高度相关.结论 6家三级医院筛查分离不动杆菌耐药严重,获得性耐药基因与可移动遗传元件遗传标记存在高度相关.
【期刊名称】《现代实用医学》
【年(卷),期】2016(028)001
【总页数】3页(P35-37)
【关键词】耐药不动杆菌;获得性耐药基因;可移动遗传元件
【作者】杨雅芸;陈琳;许小敏;梁珊燕;王春萍
【作者单位】315010宁波,宁波市第二医院;315010宁波,宁波市第二医
院;315010宁波,宁波市第二医院;315010宁波,宁波市第二医院;315010宁波,宁波市第二医院
【正文语种】中文
【中图分类】R446.6
鲍曼不动杆菌具有强大的获得性和克隆传播的能力，重症医学科（ICU）鲍曼不动杆菌表现出高度的耐药性。

为了解宁波地区成人ICU患者ASC耐药鲍曼不动杆菌的 -内酰胺类、氨基糖苷类药物和其他药物的获得性耐药基因与可移动遗传元件（MGEs）遗传标记存在状况，以及这些获得性耐药基因与MGEs的关系。

笔者对40株耐药鲍曼不动杆菌进行了55种 -内酰胺类、氨基糖苷类药物和其他药物的获得性耐药基因，13 种MGEs的遗传标记检测，并对检测结果作了指标聚类分析系；同时为了探讨部分 -内酰胺酶基因与MGEs的关系，作了 ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66连锁检测，现报道如下。

1.1 研究对象选取2013年1—12月入住宁波市第一医院、宁波市第二医院、宁
波市医疗中心李惠利医院3家三甲医院和宁波市鄞州人民医院、宁波市北仑人民
医院、宁波市第六医院3家三乙院ICU时间＞48 h患者。

入住ICU后第1天患者进行肛拭子采样，法国bioMerieux公司显色培养基筛查，共收集40株菌株。

1.2 菌种鉴定及药敏试验菌种鉴定先用法国生物梅里埃公司全自动微生物鉴定仪
作初步筛查，继而进一步作gyrA基因扩增测序（gyrA 引物 P1：5’-AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT-3’；P2：5’-GCCATACCTACGGCGATACC-3’，测得序列与BLASTn比对。

药敏试验为VITEK2及K-B法，抗菌药物敏感性
判断根据2014CLSI进行。

1.3 细菌DNA模板制备蛋白酶K裂解法。

1.4 基因检测全部基因检测均为聚合酶链反应（PCR）法，完全按照试剂盒说明书操作。

检测项目：（1）-内酰胺类药物获得性耐药基因。

TEM、SHV、CTXM-1群、CTX-M-2群、CTX-M-3群、CTX-M-9群、CTX-M-25群、PER、VEB、GES、CARB、RTG、KPC、SCO、IMP、VIM、SIM、SPM、GIM、AIM、NDM、KHM、DIM、TMB、ADC、DHA、OXA-1群、OXA-2群、OXA-10群、OXA-23群、OXA-24群、OXA-51群、OXA-58群。

（2）氨基糖苷类获得性耐药基因。

aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰad、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(2")-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ、ant (4')-Ⅰ、aph3'-Ⅰ、armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA。

（3）其他药物获得性耐药基因。

qepA、qnrA、qnrB、qnrS、aac (6')-Ⅰb-cr、adeB、qacE△1。

（4）MGEs的遗传标记。

traA、trbC、intⅠ1、
intⅠ2、intⅠ3、tnpU、tnp513、IS26、IS903、ISaba1、ISaba4、ISaba9、merA。

（5）连锁检测基因。

ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66。

1.5 阳性基因测序和聚类分析 PCR产物用ABI公司3730（美国）全自动荧光法测序。

用Chromas直接作BLAST Search网上比对。

UPGMA法作指标聚类分析。

2.1 药敏检测结果 40株耐药鲍曼不动杆菌对替加环素敏感率50.0%，头孢哌酮/舒巴坦敏感率12.5%，中敏率60.0%，对其他常用抗菌药物均耐药。

见表1。

2.2 基因检测结果 -内酰胺酶TEM、ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-66检出
率100.0%，OXA-24检出率5.0%。

氨基糖苷类获得性耐药基因aac(3)-Ⅰ检出率15.0%，aac(6')-Ⅰb检出率25.0%，ant (2")-Ⅰ检出率20.0%，aph(3')-Ⅰ、armA 16SrRNA甲基化酶基因检出率25.0%；MGEs遗传标记intⅠ、tnpU1、tnp513检出率25.0%，IS26、ISaba1检出率100.0%；连锁检测ISaba1-ADC、
ISaba1-OXA-23检出率100.0%，ISaba1-OXA-66未检出；其他药物获得性耐药基因adeB检出率100.0%，qacE△1检出率25.0%。

2.3 检测基因结果的指标聚类分析获得性耐药基因 OXA-2群、OXA-23、OXA-66及ADC、adeB与MGEs遗传标记IS26、ISaba1高度相关。

鲍曼不动杆菌的整合子、转座子（含插入序列）和接合性质粒等MGEs能将自身的整合酶基因、转座酶基因、接合（性毛）基因以及所携带的耐药基因在同种细菌不同菌株之间和不同种细菌菌株之间传播，从而使其所携带的耐药基因快速播散[1]。

所以ICUASC耐药鲍曼不动杆菌阳性者，在接下来的住院期间更易发生该细菌的感染，需要对患者进行床旁的接触隔离。

本组菌株获得性耐药基因检测显示，-内酰胺酶 ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-24及OXA-66等基因的高检出率与包括亚胺培南和美洛培南在内的头孢类药物高耐药率一致；氨基糖苷类修饰酶基因和armA 16SrRNA甲基化酶基因的检出率与氨基糖苷类药物耐药率一致。

连锁检测ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23均呈阳性。

连锁检测进一步验证了ADC-67和OXA-232种 -内酰胺酶基因均由插入序列 ISaba1介导。

并由ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23测序图ISaba1的IRL区可见，两者有一个碱基差别。

这与文献报道相同[2-3]。

ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23两者有一个碱基差别又说明菌株拥有 2个不同的ISaba1拷贝（它们的IRL区不同）。

由于转座子、插入序列自带启动子导致相邻基因的高表达[4-6]。

本文的连锁检测ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23均呈阳性，并提示ADC-67和OXA-23 2 种-内酰胺酶基因有可能高表达。

对耐药鲍曼不动杆菌进行 ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66连锁检测国内为首次。

【相关文献】
[1] 王卫华,陈洁,毛雄英,等.泛耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药基因与可移动遗传元件检测与指标聚类分析[J].中华临床感染病杂志,2012,5(1):9-13.
[2] Heritier C,Poirel L,Nordmann P.Cepha-losporinase over-expression resulting from insertion of ISAba1 in Acinetobacter ba-umannii[J].Clin Microbiol Infect,2006, 12:123-130.
[3] Corvec S,Poirel L,Naas T,et al.Genetics and Expression of the Carbapenem-Hy-drolyzing Oxacillinase Gene blaOXA-23 in Acinetobacter baumannii[J].Antimi-crob Agents Chemother,2007,51(4): 1530-1533.
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[5] Figueiredo S,Poirel L,Croize J,et al.In Vivo Selection of Reduced Susceptibility to Carbapenems in Acinetobacter baum-annii Related to ISAba1-Mediated Overexpression of the Natural blaOXA-66 Oxacillinase Gene[J].Antimicrob Agents
Chemother,2009,53(6):2657-2659.
[6] Figueiredo S,Poirel L,Papa A,et al.Over-expression of the Naturally Occurring bla-OXA-51 Gene in Acinetobacter baumannii Mediated by Novel Insertion Sequence
ISAba9[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(9):4045-4047.。