复合酶法同步提取葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维的响应面优化

复合酶法同步提取葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维的响应面
优化
张爱琴;孙乾;李芳;孔令明;邹积赟
【摘要】用复合酶法同步提取葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维.实验选用木瓜蛋白酶和纤维素酶进行提取,在单因素实验的基础上,应用响应面法优化提取条件,确定复合酶提取葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维的提取率.结果表明,优化工艺为:木瓜蛋白酶和纤维素酶之比3∶1,提取温度50℃,料液比1∶20 (g/mL),提取pH7.0,提取时间50 min,蛋白质的提取率为83.07％±1.43％、可溶性膳食纤维得率为34.04％±0.87％.因此,选用复合酶法对葡萄籽粕中蛋白质和可溶性膳食纤维进行同步提取具有一定的可行性,也为其他副产物同步提取蛋白质与可溶性膳食纤维提供了理论指导.
【期刊名称】《食品工业科技》
【年(卷),期】2019(040)003
【总页数】7页(P134-140)
【关键词】复合酶法;同步提取;葡萄籽粕;蛋白质;膳食纤维
【作者】张爱琴;孙乾;李芳;孔令明;邹积赟
【作者单位】新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052;新疆轻工职业技术学院,新疆乌鲁木齐830021;新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052;新疆乡都酒业有限公司,新疆乌鲁木齐841100
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
葡萄皮渣是葡萄榨汁和酿酒加工过程中产生的大量副产物,占葡萄加工量的25%～30%,其中主要含有葡萄皮、果梗、种子等[1-2]。

葡萄籽在副产物中所占比例较大,高达90%;葡萄籽中蛋白质含量较高,经榨油后的饼粕中仍含有13～16%的蛋白质[3];另外,葡萄籽中的总膳食纤维(Total dietary fiber,简称TDF)占总质量的75%,可溶性膳食纤维(SDF)含量占TDF的15%[4]。

除蛋白质与膳食纤维外,还含有17种氨基酸,其中包括人体所需的8种必需氨基酸,这与大豆中的氨基酸含量基本一致,且主要为缬氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸等,还有许多K、Ca、P等常微量元素[5]。

Ping H E等[6]用蛋白酶酶解葡萄籽中以结合状态存在的蛋白质,使多肽游离出来,从而达到分离目的。

Villanueva-Su等[7]对豆渣进行了一系列的酶提取,酶提取法使得可溶性膳食纤维的组分增加,并且提高了可溶与不溶纤维的比例。

Aurora等[8]用木霉酶处理小麦和大麦,使得提取的总DF 的量基本没有变化,而可溶性膳食纤维的量提高了3倍。

以往的研究大多集中于用酶法对蛋白质和膳食纤维进行分步提取,而在蛋白质和膳食纤维的同步提取、富集方面鲜有相关报道。

因此,以葡萄籽饼粕为原料,利用复合酶法对其中的蛋白质和可溶性膳食纤维进行同步提取,通过对料液比、pH、温度和时间等因素进行单因素及响应面试验并优化提取条件,以期达到对葡萄籽饼粕中蛋白质和膳食纤维的同步提取和富集的目的,为葡萄籽饼粕的合理开发以及酿酒副产物中有效营养成分的提取提供理论依据和有利支撑。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
葡萄籽粕新疆乡都葡萄酒有限公司;1 mol/L NaOH溶液,木瓜蛋白酶(活力
≥800000 U/g)、纤维素酶(活力≥100000 U/g) 上海源叶生物有限公司。

FW-100高速万能粉碎器北京市永光明医疗仪器有限公司;筛子(40目) 浙江省上虞市道墟纱筛厂;RE-85C 旋转蒸发器上海青浦沪西仪器厂;JB/T5374-1991 电子天平海特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DZKW-S-6 电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器有限公司;MYP11-2磁力搅拌器上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;普通型移
液器(10、200、1000 μL) 上海荣泰生化工程有限公司;PHS-300 pH计江苏盛奥
华环保科技有限公司;TDL-5-A低速台式离心机上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法
1.2.1 脱脂葡萄籽粕粉末的制备葡萄籽粕用万能粉碎机粉碎并过40目筛,把过筛的粉放在烧杯中,在常温下倒入正己烷用玻璃棒不停搅拌,反复提取直至没有油脂析出,15 min、4500 r/min离心之后将滤液合并,在真空度0.8 MPa、温度65 ℃的
旋转蒸发仪上进行正己烷的回收,回收得到的沉淀物在40 ℃的鼓风干燥箱内干燥,
最后制得脱脂葡萄籽粕粉末[9-10]。

1.2.2 葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维的提取准确称取脱脂葡萄籽粕,加蒸馏水
调匀,用NaOH调节至所需pH，并加入木瓜蛋白酶和纤维素酶,充分反应后90 ℃
水浴灭酶,离心10 min,收集上清液在参数为:进口温度160 ℃、进料速率400
mL/h情况下进行喷雾干燥,即得蛋白质和可溶性膳食纤维混合粉[11-13],并对蛋白质和可溶性膳食纤维的含量进行测定。

1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 木瓜蛋白酶和纤维素酶之比对提取的影响在加酶量为2%、料液比为
1∶20 g/mL、浸提温度50 ℃、浸提时间60 min、浸提液pH6.0,复合酶之比设
定为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4,在上述条件下探讨不同复合酶之比对葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维提取的影响,从而确定最佳的复合酶比例。

1.2.3.2 料液比对提取的影响在加酶量为2%、复合酶之比为3∶1、浸提温度
50 ℃、浸提时间60 min和浸提液pH6.0,料液比设定为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL,在上述条件下探讨不同料液比对葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳
食纤维提取的影响,从而确定最佳料液比。

1.2.3.3 pH对提取的影响在加酶量为2%、复合酶之比为3∶1、料液比为1∶20
g/mL、浸提温度50 ℃和浸提时间60 min,浸提液pH设定为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,在上述条件下探讨不同浸提pH对葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维提取的影响,从而确定最佳的pH。

1.2.3.4 浸提时间对提取的影响在加酶量为2%、复合酶之比为3∶1、料液比为
1∶20 g/mL、浸提温度50 ℃和浸提液pH6.0,浸提时间设定为30、40、50、60、70 min,在上述条件下探讨不同浸提温度对葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维提取
的影响,从而确定最佳的浸提时间。

1.2.3.5 浸提温度对提取的影响在加酶量为2%、复合酶之比为3∶1、料液比为
1∶20 g/mL、浸提时间60 min和浸提液pH6.0,浸提温度设定为40、45、50、55和60 ℃,在上述条件下探讨不同浸提温度对葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维
提取的影响,从而确定最佳的浸提温度。

1.2.4 响应面试验响应面实验设计因素水平表如表1所示。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factor and levels tabe of response surface assay水平因素A料液比(g/mL)B pHC时间(min)D温度(℃)-
11∶155.0404501∶206.0505011∶257.06055
1.2.5 蛋白质含量测定测定葡萄籽粉中蛋白质运用凯氏定氮法和考马斯亮蓝G-
250[14]。

蛋白质提取率(%)=(提取液中蛋白质的含量/葡萄籽中蛋白质的含量)×100
式(1)
式中:提取液中蛋白质的含量采用考马斯亮蓝法测定,葡萄籽中总蛋白的含量采用凯
氏定氮法测定。

1.2.6 可溶性膳食纤维得率的计算参照国家标准:GB 5009.88-2014[15]进行测定。

可溶性膳食纤维得率(%)=(可溶性膳食纤维的质量/原料总质量)×100
式(2)
1.3 数据处理
运用Minitab 16.0对本次试验的数据进行处理,运用Excel 2003和Design Expert 8.0.6中Box-Behnken进行图形制作。

2 结果与分析
2.1 蛋白质标准曲线的建立
如图1所示得到线性回归方程:Y=0.0075X+0.02517,决定系数R2=0.9968,说明牛血清白蛋白在浓度0～100 μg/mL,线性关系良好。

图1 蛋白质提取液测定标准曲线Fig.1 Protein extract determination standard curve
2.2 单因素实验
2.2.1 木瓜蛋白酶与纤维素酶之比对蛋白质和可溶性膳食纤维提取效果的影响由图2得出,在木瓜蛋白酶和纤维素酶的比例由4∶1增加为3∶1时，蛋白质的提取率
显著性增加(p<0.05),3∶1时蛋白质提取率达到最大值。

随着复合酶配比中木瓜蛋白酶的逐渐减少和纤维素酶的逐渐增加,蛋白质的提取率逐渐下降;在木瓜蛋白酶和
纤维素酶的比例为2∶1时，相比4∶1时可溶性膳食纤维的得率显著增加
(p<0.05),2∶1时得率达到最大,但继续改变木瓜蛋白酶和纤维素酶的比例时得率,
并无显著变化(p>0.05),而在1∶3时,可溶性膳食纤维的得率又有所增加,可能是在
酶解过程中,随着纤维素酶不断增加，不溶性膳食纤维一部分转变成可溶性膳食纤维,另一部分转化为其他的物质。

通过可溶性膳食纤维得率的变化可知,当酶加入过
量时,一些不溶性膳食纤维就会被分解成一些如多糖、单糖这类的小分子物质,在沉淀时小分子物质不容易被沉淀,所以膳食纤维的提取率有所下降[16-17]。

综合分析选取3∶1为酶的最佳比。

图2 木瓜蛋白酶与纤维素酶之比对提取率的影响Fig.2 Effect of ratio of papain to cellulase on extraction rate
2.2.2 料液比对蛋白质和可溶性膳食纤维提取效果的影响由图3可知,葡萄籽粕中蛋白质提取率和可溶性膳食纤维得率随着料液比升高而有所变化。

在1∶10～1∶25 g/mL时,蛋白质的提取率显著增加(p<0.05),随着料液比继续增加,提取率并无显著变化(p>0.05);在1∶10～1∶15 g/mL时可溶性膳食纤维的得率有显著的增加(p<0.05),料液比为1∶15～1∶20时，可溶性膳食纤维得率继续增加，但差异不显著(p>0.05),料液比继续增加时水溶性膳食纤维得率有明显的下降趋势。

细胞内外的渗透压力发生变化,导致底物浓度过低分子间的扩散速度增加,分散不均匀,体系的粘度逐渐降低,局部酸碱度过高,酶的活性降低[18-19]。

并且与实际生产相结合综合因素考虑,选择料液比以1∶20为佳。

图3 料液比对提取率影响Fig.3 Effect of material to liquid ratio on extraction rate
图4 pH对提取率的影响Fig.4 Effect of pH value on extraction rate
2.2.3 pH对蛋白质和可溶性膳食纤维提取效果的影响由图4可知,葡萄籽粕中蛋白质和可溶性膳食纤维随着pH的升高有着明显的变化,在pH为4～6时,蛋白质的提取率有显著的增加(p<0.05),pH为7时提取率达到最大,当pH为7时,蛋白质的提取率达到一定的较高值7
3.26%;而当pH为4～5,可溶性膳食纤维的得率有显著性增加(p<0.05),pH为5时提取率达到最高值,之后随着pH的增加,可溶性膳食纤维的得率呈下降的趋势,因为一般情况下可溶性膳食纤维的提取都是在酸性条件下,如果酸性较弱，反应将不会进行或者进行非常慢,如果酸性比较强,反应较快不能有效
控制，从而使得产品的提取率下降[20-21]。

结合各因素考虑同步提取过程中pH 应该选择为6.0。

2.2.4 提取时间对蛋白质和可溶性膳食纤维提取效果的影响由图5得出,在反应最初的30～40 min时,蛋白质的提取率显著增加(p<0.05),40 min提取率达到最大,随着时间的不断延长,提取率反而下降;在30～60 min时,可溶性膳食纤维得率显著增加(p<0.05),60 min提取率达到最大值,随着时间的不断延长,得率有明显的下降,反应时间的增加使得果胶裂解的量增加,氢离子水解产量降低[22-23]。

由此选择50 min为最佳的酶解时间。

图5 时间对提取率的影响Fig.5 Effect of time on extraction rate
2.2.5 提取温度对蛋白质和可溶性膳食纤维提取效果的影响由图6可以得出,葡萄籽粕中蛋白质提取率和可溶性膳食纤维得率随着温度升高变化较为明显,在40～45 ℃时蛋白质的没有显著的变化(p>0.05),在50 ℃时提取率显著增大到最大值(p<0.05),但是温度继续增加提取率有下降的趋势;可溶性膳食纤维在40～45 ℃时没有显著的变化(p>0.05),在50 ℃时提取率达到最大(p<0.05),但是温度继续增加得率有下降的趋势;分析原因温度与酶的活力呈正相关,提取温度的升高会使得分子空间结构破坏的同时发生了一定的变化,所以使得提取率下降[24-25]。

由此选择50 ℃为最佳的酶解温度。

图6 温度对提取率的影响Fig.6 Effect of temperature on extraction rate
2.3 酶法提取葡萄籽粕可溶性膳食纤维的响应面试验
2.3.1 响应面实验设计方案及结果
表2 响应面优化试验结果Table 2 Response surface optimization test results 实验号ABCD膳食纤维得率(%)蛋白质提取率(%)10-1-1024.0062.562-10-1018.0054.273-100120.0058.494-100-120.5058.985-101021.0059.176-110021.0060.527-1-10016.5044.7780-10-124.5067.8590-
10125.5069.76100-11027.5070.441100-1128.0071.761200-1-
130.5072.8813000032.5079.1214000033.0082.2815110016.5055.621600003 2.5085.0017000033.5083.6518001128.0080.3719001-126.5074.632001-1025.5072.1921010124.0070.8022010-124.0069.5523011023.5068.03241-10020.0067.122510-1020.5066.0526100-
120.5064.6327100119.0060.4628101018.0058.0929000036.0084.56
2.3.2 蛋白质提取率的响应面结果分析由表3中的数据得出多元拟合回归方程料液比(A)、pH(B)、温度(C)和时间(D)如下:
Y1=82.52+3.15A+1.35B+0.92C+0.26D-7.31AB-3.22AC-0.92AD-0.31BC-0.17BD+1.71CD-17.86A2-8.98B2-4.83C2-3.62D2
模型p<0.01,表明回归模型极显著,失拟项的p值为0.5853(p>0.05),说明失拟项不显著,表明该模型拟合度良好。

在此模型中A、AB、AC、BC、A2、B2、C2、D2都是显著因子。

模型决定系数R2=0.9672,调整决定系数R2=0.9344,说明葡萄籽粕蛋白质的提取实验值与预测值之间有较好的拟合度。

表3 蛋白质回归方程的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of protein regression equation方差来源平方和自由度均方F值p显著性模型2745.7514196.1329.49<0.0001∗∗∗A118.881118.8819.060.0008∗∗B
21.90121.903.510.0911C
10.12110.121.620.2376D0.8110.810.130.7321AB213.891213.8434.29<0.000 1∗∗∗AC41.34141.346.630.0258∗∗AD3.3913.390.540.4872BC36.24136.245.8 10.0350∗∗BD0.1110.110.0170.9000CD11.76111.761.890.2047A22070.06120 70.06311.31<0.0001∗∗∗B2523.581523.5878.74<0.0001∗∗∗C2151.361151.3 622.760.0003∗∗D284.79184.7912.750.0031∗∗残差93.09146.65失拟
64.93106.490.920.5853误差28.1747.04总和
2838.3628R2=0.9672R2Adj=0.9344
注:p<0.05为显著,p<0.01为高度显著,p<0.001为极显著；表4同。

表4 可溶性膳食纤维回归方程的方差分析结果Table 4 Variance analysis results of regression equation of soluble dietary fiber方差来源平方和自由度均方F 值p显著性模型
822.41458.7434.12<0.0001∗∗∗A0.5210.520.300.5910B1.0211.020.590.4541 C0.3310.330.190.6667D0.3310.330.190.6667AB16.00116.009.290.0087∗∗AC 7.5617.564.390.0548AD0.2510.250.150.7089BC7.5617.564.390.0548BD0.25 10.250.150.7089CD4.0014.002.320.1497A2706.651706.65410.43<0.0001∗∗∗B2183.071183.07106.33<0.0001∗∗∗C258.38158.3833.91<0.0001∗∗∗D258. 38158.3833.91<0.0001∗∗∗残差24.10141.72失拟15.60101.560.730.6858误差8.5042.12总和846.5028R2=0.9715R2Adj=0.9430
2.3.3 膳食纤维得率的响应面结果分析由表3中的数据可以得出多元拟合回归方程料液比(A)、pH(B)、温度(C)和时间(D)如下:
Y2=33.05-0.21A-0.29B-0.17C-0.17D-2.00AB-1.38AC-0.25AD-1.37BC-
0.25BD+1.00CD-10.44A2-5.31B2-3.00C2-3.00D2
模型p<0.0001,表明回归模型极显著,失拟项的p值为0.6858(p>0.05),说明失拟项不显著,表明该模型拟合度良好。

在此模型中AB、A2、B2影响极显著
(p<0.001),A、AC、BC、C2、D2影响高度显著(p<0.01)。

模型决定系数
R2=0.9715,调整决定系数R2=0.9430,说明葡萄籽粕可溶性膳食纤维的提取实验值与预测值之间有较好的拟合度。

图7 蛋白质的各因素与提取率的响应面及等高线图Fig.7 Response surface and contour map of various factors and extraction rates of protein
图8 膳食纤维各因素之间的响应面及等高线图Fig.8 Response surface and
contour map between dietary fiber factors
通过响应面法对提取工艺进行优化,以四因素三水平确定二次回归方程,拟合单因素
与葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维和提取率之间的函数关系,进行响应面的形状
拟合,所得到的蛋白质的响应面图为图7,葡萄籽粕蛋白质料液比、酶解温度、酶解
时间、pH的变化呈现先升高后下降的趋势,等高线较为密集状态,均在试验测定范
围之内。

可溶性膳食纤维的响应面图为图8。

可溶性膳食纤维得率随着物料与水之比、酶解温度、酶解时间、pH的变化呈现先升高后下降的趋势,等高线较为密集状态,均在
试验测定范围之内。

综上所述,蛋白质和可溶性膳食纤维得率不是简简单单的线性
关系,也不仅仅受温度、时间、料液比和pH的影响,各个因素都在不同程度地影响
着蛋白质和可溶性膳食纤维的提取率，且各因素之间相互交错。

2.3.4 提取工艺条件的优化和可靠性验证通过单因素和响应面的29组实验可以得
出pH7.02、提取温度50.21 ℃和提取时间50.66 min、料液比1∶20.37 g/mL
的条件下葡萄籽粕蛋白质的理论提取率为82.70%。

pH6.99、提取温度49.74 ℃、提取时间44.84 min和料液比1∶19.97 g/mL的条件下葡萄籽粕可溶性膳食纤维的理论得率为33.51%。

综合因素考虑到可操作性,将最优条件定为:提取温度50 ℃、pH7.0、料液比为1∶20 g/mL,提取时间50 min,此时得到葡萄籽粕蛋白质提取率
可达83.07%±1.43%,可溶性膳食纤维的得率为34.04%±0.87%。

与理论值较为接近,由此得出对优化葡萄籽粕蛋白质和可溶性膳食纤维的酶法提取工艺建立的数学
模型是可行的。

3 结论
本实验通过单因素实验对葡萄籽粕蛋白质提取率和可溶性膳食纤维得率进行了分析,根据温度、时间、料液比、pH对实验的单因素控制,经响应面实验优化同一工艺同步提取的最佳的工艺参数为提取温度50 ℃、料液比1∶20 g/mL、提取时间50
min、pH7.0、蛋白质提取率可达83.07%±1.43%,可溶性膳食纤维得率可达34.04%±0.87%。

说明响应面法建立的数学模型对葡萄籽粕中蛋白质和可溶性膳食纤维同步提取具有稳定可靠性。

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