一抗二抗的选择课件
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➢ IgM
正常情况下，脐血IgM含量为40～240mg/L，血内IgM含量新生儿为50～300mg/L，0.5～6个月为 150～1090mg/L，6个月～2岁为430～2390mg/L，2～6岁为500～1990mg/L， 6～12岁为500～ 2600mg/L，12～16岁为450～2400mg/L，成人为400～3450mg/L。
.
11
• 免疫球蛋白在不同疾病的浓度高低
➢ IgG
正常情况下，脐血IgG含量为7.6～17g/L；血IgG含量新生儿为7.0～14.8 g/L，0.5～6个月为3～10.0 g/L，6个月～2岁为5～12 g/L，2～6岁为5～13g/L，6～12岁为7～16.5g/L，12～16岁为7～15.5g/L， 成人为6～16g/L。
一抗、二抗的选择
.
1
一抗的选择
• 1.分析实验应用类型 ➢WB（Western Blot 免疫印迹 ） ➢IHC （immunohistochemistry免疫组织化学） ➢ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶
联免疫吸附试验 ）
.
2
• 2.样本蛋白的结构性质
• 如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化 外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗 体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本的 western blotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物 和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含IgG， 在western blot检测中则结合出现IgG分子50 and 25 kDa的 重链和轻链条带。
.
16
• 针对某一种属的抗体可能会和其他一些种属有交叉 反应。牛血清白蛋白和奶粉可能含有与抗牛IgG、抗 山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG等抗体反应的IgG， 因此如果使用它们作为封闭液或抗体稀释液的成分， 会增加背景染色和降低抗体的效价。
• 简单说，如果用的是抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马 IgG、抗绵羊IgG的二抗，那么封闭过程中就尽量不 要用牛血清白蛋白和奶粉，以免交叉反应造成背景 染色增加和抗体效价降低。
.
9
• 5.二抗的类别亚型
➢IgM是体液免疫应答首先产生的Ig。
➢IgA是机体黏膜防御感染的重要因素。
➢IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它 仅以单体形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病 毒抗体属于IgG
➢IgE是同速发型过敏反应发生有关的Ig。
➢IgD以膜结合形式存在于B细胞，在B细胞分化发 育中起重调节有作用
式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗， 免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的
二抗。 如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用
Biotin/Avidin检测系统。 在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记； 金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。
.
8
• 4.是否经过血清吸附过的二抗
IgA增高：在慢性肝病，亚急性或慢性感染性疾病（如结核、真菌感染等）、自身免疫性疾病（如 SLE、类风湿关节炎）、囊性纤维化、家族性嗜中性粒细胞减少症、乳腺癌、IgA肾病、IgA骨髓瘤等 情况下；
IgA降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、免疫缺陷病、选择性IgA缺乏症、无γ－球蛋白血症、蛋白 丢失性肠病、烧伤、抗IgA抗体综合症、免疫抑制剂治疗、妊娠后期等情况下。
• 机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。 经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可 长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。
• IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM抗体的测 定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。
• IgM 是抗原刺激诱导体液免疫应答中最先产生的Ig ，IgM 不是细胞，但可结合补体，主要分布于血清中。由于IgM 有较高的结合价，所以是高效能的抗生物抗体，其杀菌、 溶菌、促吞噬和凝集作用比IgG 高500- 1000 倍，IgM 在机 体的早期防御中起着重要的作用。
.
5
二抗的选择
• 1.一抗的种属来源 二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，
.
6
• 2.二抗的种属来源
一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必 然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗 在一般的实验里没有太多的差别。
在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中 一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则 相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时 候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。
.
7
• 3二抗的偶联标记
➢ 主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生 物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、Rhodamine、 Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金 颗粒。
➢选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。 对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗； 细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流
IgM增高：在胎儿宫内感染、新生儿TORC H综合症、慢性或亚急性感染、疟疾、传染性单核细胞增
多症、支原体肺炎、肝病、结缔.组织疾病、巨球蛋白血症，无症状性单克隆1Ig2M病等情况下，；
IgM降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性IgM缺乏症、蛋白丢失性
IgM
• IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链， 具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五 个抗原结合价。IgM分子量约为900000，IgG分子量约为 150000。
➢ 样本蛋白的结构域 全长蛋白、蛋白片段、多肽、 细菌、细胞
蛋白片断检 测活细胞的表面 蛋白
用含此片段域 的免疫原制备 出的抗体。
用含该表面蛋 白的胞外域来 免疫制备的抗 体。
➢ 样本的提取和处理过程
某些抗体要求样本经过某些特殊处理， 例如：许多抗体只识别还原和变性的、 表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋 白样本，
.
10
• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法 ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用 抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一 般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合 固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。 因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体， 必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去 IgG的干扰。
➢为减少二抗与样本的非特异性结合，可选择经过 血清吸附过的二抗
➢如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克 隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果 对实验的特异性要求很高，选择经过人血清吸附 过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清 吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非 特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最 低。
IgG
• 人体血清免疫球蛋白IgG是初级免疫应答中最持久、 最重要的抗体，它仅以单体形式存在。
• 大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在 抗感染中起到主力军作用，它能够促进单核巨噬 细胞的吞噬作用（调理作用），中和细菌毒素的 毒性（中和毒素）和病毒抗原结合使病毒失去感 染宿主细胞的能力（中和病毒）。
.
4
• 4.一抗宿主物种的选择
• 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗 宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可 能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本 内源性免疫球蛋白产生交叉反应，
• 例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一 抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子 （酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。
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13
IgA
➢IgA 分血清型和分泌型两种， 血清型多为单体，也有二聚体，血清型IgA可介导调理吞
噬ADCC 作用； 分泌型的都是二聚体，且含有分泌片。 分泌型IgA（SIgA）是机体粘膜防御系统的主要成分，覆
盖在鼻、咽、气管、肠和膀胱粘膜的表面，它能抑制微生 物在呼吸道上皮附着，减缓病毒繁殖，是粘膜重要屏障， 对某些病毒、细菌和—般抗原具有抗体活性，是防止病原 体入侵机体的第一道防线。 外来抗原进入呼吸道或消化道，局部免疫系统受到刺激后， 无需中央免疫系统的参与，自身就可进行免疫应答，产生 分泌型抗体，即SIgA。 已有研究证明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影响 呼吸道粘膜对病原体的抵抗力，两者呈正相关。 ➢初乳中含有分泌型的sIgA 。 ➢IgA的凝聚物可以通. 过经典途径激活补体。 14
• IgG 在机体合成的年龄要晚于IgM，在出生后第3 个月开始合成，3-5 岁接近成年人水平。
• 它是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重 要作用。此外，IgG 还具有调理吞噬和结合SPA等 作用。
.
15
【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】
➢在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞 等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择AntiIgG, F（ab’）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部 分与IgG的非特异性结合。 ➢常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即 与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合； ➢由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L） 与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc 片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合。
.
17
某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。 当选择免疫组化的抗体时，应注意某些 抗体只识别未固定的冷冻的组织，
另一些抗体则适用于无需抗原修复解交
联步聚的甲醛固定石蜡包. 埋的组织，
3
• 3.样本的物种
选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与 不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸 序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说 明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体 不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种 尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方 法来预测交叉反应，可应用 Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源 性比对。
IgG增高：患慢性肝病、亚急性或慢性感染、结缔组织疾病、IgG骨髓瘤、无症状性单克隆IgG病等； IgG降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合征、选择性IgG缺乏症、蛋白丢失性
肠病、肾病综合症、强直性肌营养不良、免疫抑制剂治疗等情况下。
➢ IgA
正常情况，脐血IgA含量为0～50mg/L; 血内IgA含量新生儿为0～22mg/L，0.5～6个月为3～820mg/L， 7个月～2岁为140～1080 mg/L，2～6岁为230～1900mg/L，6～12岁为290～2700mg/L，12～16岁 为810～2320mg/L，成人为760～3900mg/L。
正常情况下，脐血IgM含量为40～240mg/L，血内IgM含量新生儿为50～300mg/L，0.5～6个月为 150～1090mg/L，6个月～2岁为430～2390mg/L，2～6岁为500～1990mg/L， 6～12岁为500～ 2600mg/L，12～16岁为450～2400mg/L，成人为400～3450mg/L。
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• 免疫球蛋白在不同疾病的浓度高低
➢ IgG
正常情况下，脐血IgG含量为7.6～17g/L；血IgG含量新生儿为7.0～14.8 g/L，0.5～6个月为3～10.0 g/L，6个月～2岁为5～12 g/L，2～6岁为5～13g/L，6～12岁为7～16.5g/L，12～16岁为7～15.5g/L， 成人为6～16g/L。
一抗、二抗的选择
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一抗的选择
• 1.分析实验应用类型 ➢WB（Western Blot 免疫印迹 ） ➢IHC （immunohistochemistry免疫组织化学） ➢ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶
联免疫吸附试验 ）
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• 2.样本蛋白的结构性质
• 如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化 外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗 体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本的 western blotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物 和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含IgG， 在western blot检测中则结合出现IgG分子50 and 25 kDa的 重链和轻链条带。
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• 针对某一种属的抗体可能会和其他一些种属有交叉 反应。牛血清白蛋白和奶粉可能含有与抗牛IgG、抗 山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG等抗体反应的IgG， 因此如果使用它们作为封闭液或抗体稀释液的成分， 会增加背景染色和降低抗体的效价。
• 简单说，如果用的是抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马 IgG、抗绵羊IgG的二抗，那么封闭过程中就尽量不 要用牛血清白蛋白和奶粉，以免交叉反应造成背景 染色增加和抗体效价降低。
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• 5.二抗的类别亚型
➢IgM是体液免疫应答首先产生的Ig。
➢IgA是机体黏膜防御感染的重要因素。
➢IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它 仅以单体形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病 毒抗体属于IgG
➢IgE是同速发型过敏反应发生有关的Ig。
➢IgD以膜结合形式存在于B细胞，在B细胞分化发 育中起重调节有作用
式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗， 免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的
二抗。 如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用
Biotin/Avidin检测系统。 在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记； 金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。
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• 4.是否经过血清吸附过的二抗
IgA增高：在慢性肝病，亚急性或慢性感染性疾病（如结核、真菌感染等）、自身免疫性疾病（如 SLE、类风湿关节炎）、囊性纤维化、家族性嗜中性粒细胞减少症、乳腺癌、IgA肾病、IgA骨髓瘤等 情况下；
IgA降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、免疫缺陷病、选择性IgA缺乏症、无γ－球蛋白血症、蛋白 丢失性肠病、烧伤、抗IgA抗体综合症、免疫抑制剂治疗、妊娠后期等情况下。
• 机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。 经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可 长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。
• IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM抗体的测 定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。
• IgM 是抗原刺激诱导体液免疫应答中最先产生的Ig ，IgM 不是细胞，但可结合补体，主要分布于血清中。由于IgM 有较高的结合价，所以是高效能的抗生物抗体，其杀菌、 溶菌、促吞噬和凝集作用比IgG 高500- 1000 倍，IgM 在机 体的早期防御中起着重要的作用。
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二抗的选择
• 1.一抗的种属来源 二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，
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6
• 2.二抗的种属来源
一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必 然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗 在一般的实验里没有太多的差别。
在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中 一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则 相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时 候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。
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• 3二抗的偶联标记
➢ 主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生 物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、Rhodamine、 Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金 颗粒。
➢选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。 对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗； 细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流
IgM增高：在胎儿宫内感染、新生儿TORC H综合症、慢性或亚急性感染、疟疾、传染性单核细胞增
多症、支原体肺炎、肝病、结缔.组织疾病、巨球蛋白血症，无症状性单克隆1Ig2M病等情况下，；
IgM降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性IgM缺乏症、蛋白丢失性
IgM
• IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链， 具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五 个抗原结合价。IgM分子量约为900000，IgG分子量约为 150000。
➢ 样本蛋白的结构域 全长蛋白、蛋白片段、多肽、 细菌、细胞
蛋白片断检 测活细胞的表面 蛋白
用含此片段域 的免疫原制备 出的抗体。
用含该表面蛋 白的胞外域来 免疫制备的抗 体。
➢ 样本的提取和处理过程
某些抗体要求样本经过某些特殊处理， 例如：许多抗体只识别还原和变性的、 表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋 白样本，
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• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法 ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用 抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一 般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合 固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。 因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体， 必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去 IgG的干扰。
➢为减少二抗与样本的非特异性结合，可选择经过 血清吸附过的二抗
➢如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克 隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果 对实验的特异性要求很高，选择经过人血清吸附 过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清 吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非 特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最 低。
IgG
• 人体血清免疫球蛋白IgG是初级免疫应答中最持久、 最重要的抗体，它仅以单体形式存在。
• 大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在 抗感染中起到主力军作用，它能够促进单核巨噬 细胞的吞噬作用（调理作用），中和细菌毒素的 毒性（中和毒素）和病毒抗原结合使病毒失去感 染宿主细胞的能力（中和病毒）。
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• 4.一抗宿主物种的选择
• 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗 宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可 能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本 内源性免疫球蛋白产生交叉反应，
• 例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一 抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子 （酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。
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IgA
➢IgA 分血清型和分泌型两种， 血清型多为单体，也有二聚体，血清型IgA可介导调理吞
噬ADCC 作用； 分泌型的都是二聚体，且含有分泌片。 分泌型IgA（SIgA）是机体粘膜防御系统的主要成分，覆
盖在鼻、咽、气管、肠和膀胱粘膜的表面，它能抑制微生 物在呼吸道上皮附着，减缓病毒繁殖，是粘膜重要屏障， 对某些病毒、细菌和—般抗原具有抗体活性，是防止病原 体入侵机体的第一道防线。 外来抗原进入呼吸道或消化道，局部免疫系统受到刺激后， 无需中央免疫系统的参与，自身就可进行免疫应答，产生 分泌型抗体，即SIgA。 已有研究证明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影响 呼吸道粘膜对病原体的抵抗力，两者呈正相关。 ➢初乳中含有分泌型的sIgA 。 ➢IgA的凝聚物可以通. 过经典途径激活补体。 14
• IgG 在机体合成的年龄要晚于IgM，在出生后第3 个月开始合成，3-5 岁接近成年人水平。
• 它是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重 要作用。此外，IgG 还具有调理吞噬和结合SPA等 作用。
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15
【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】
➢在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞 等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择AntiIgG, F（ab’）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部 分与IgG的非特异性结合。 ➢常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即 与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合； ➢由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L） 与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc 片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合。
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某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。 当选择免疫组化的抗体时，应注意某些 抗体只识别未固定的冷冻的组织，
另一些抗体则适用于无需抗原修复解交
联步聚的甲醛固定石蜡包. 埋的组织，
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• 3.样本的物种
选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与 不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸 序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说 明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体 不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种 尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方 法来预测交叉反应，可应用 Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源 性比对。
IgG增高：患慢性肝病、亚急性或慢性感染、结缔组织疾病、IgG骨髓瘤、无症状性单克隆IgG病等； IgG降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合征、选择性IgG缺乏症、蛋白丢失性
肠病、肾病综合症、强直性肌营养不良、免疫抑制剂治疗等情况下。
➢ IgA
正常情况，脐血IgA含量为0～50mg/L; 血内IgA含量新生儿为0～22mg/L，0.5～6个月为3～820mg/L， 7个月～2岁为140～1080 mg/L，2～6岁为230～1900mg/L，6～12岁为290～2700mg/L，12～16岁 为810～2320mg/L，成人为760～3900mg/L。