高中生物选修1《生物技术实践》复习计划知识梳理2

选修1?生物技术实践?知识梳理
专题一 课题1果酒和果醋的制作
【补充知识】发酵
1、概念：利用微生物在有氧或无氧条件下 的生命活动来制备微生物菌体及各种不同代谢产物 的过程.
2、类型：
1〕根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵。

2〕根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等。

一、根底知识
〔一〕果酒制作的原理
1．菌种是酵母菌，属于真核生物，新陈代谢类型异养兼性厌氧型 ，有氧时，进行有氧呼吸， 酶
大量繁殖〔以出芽生殖为主〕，反响式为： C 6H 12O 6+6H 2O+6O 2 →6CO 2+12H 2O+能量；无
酶
氧时，能进行酒精发酵，反响式为：C6H12O6→2C 2H5OH+2CO2+能量。

2．酵母菌繁殖的最适温度 20℃左右，酒精发酵一般控制在 18～25℃。

3．自然发酵过程中，起作用的主要是 附着于葡萄皮上 的野生型酵母菌。

〔二〕果醋制作的原理
1．菌种是醋酸菌，属于原核生物，新陈代谢类型为 异养需氧型。

只有在氧气充足时，才能
进行旺盛的生命活动。

变酸的酒
外表观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖形
成的，其
繁殖方式为分裂生殖。

2．当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的
糖分解成醋酸，当缺少糖源时，醋酸
菌将
乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，反响简式为
酶
C2H5OH+O2→CH 3COOH+H2O 。

3．醋酸菌的最适生长温度为 30～35℃。

4．菌种来源：到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购置，或从食醋中别离醋酸菌。

二、实验流程图
挑选葡萄冲洗榨
汁
酒精发
酵果酒〔→醋酸发酵→果醋〕
三、操作提示
〔一〕材料的选择与处理
选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄
进行冲洗〔冲洗的目是洗去灰尘，且不要太干
净，
以防止洗去野生型酵母菌〕，然后再除去枝
梗。

〔二〕防止发酵液被污染
1、榨汁机要清洗干净，并晾干。

2、发酵瓶要清洗干净，用体积分数70%的酒精消毒。

3、装入葡萄汁后，封闭充气口。

〔三〕控制好发酵条件
1、葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约1/3的空间〔目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；同时可防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出〕。

2、制作葡萄酒过程中，将温度严格控制在18～25℃，时间控制在10～12d左右，可通过出
1
料口对发酵的情况进行及时的监测。

3、制作葡萄醋的过程中，将温度严格控制在30～35℃，时间控制在7～8d左右，并注意适时通过充气口充气。

四、课题延伸
〔一〕如何判断果酒的制作是否成功？
1、发酵后取样，通过嗅味或品尝进行初步鉴定；
2、显微镜观察酵母菌数量变化进行鉴定；
3、，用重铬酸钾来检验是否有酒精产生。

在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反响呈现灰绿色。

检测时，先在试管中参加发酵液2mL，再滴入物质的量的浓度为3mol/L的H2SO43滴，振
荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴。

〔二〕如何判断果醋的制作是否成功？
1、通过嗅味或品尝进行初步鉴定；
2、显微镜观察醋酸菌数量变化进行鉴定；
3、检测发酵前后的PH作进一步鉴定。

【教材答案】
〔一〕旁栏思考题
1.你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？
答：应该先冲洗，然后再除去枝梗，以防止除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的时机。

2.你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
提示：葡萄应先冲洗、再去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖、不要
完全揭开瓶盖等。

3.制葡萄酒时，为什么要将温度控制在18～25℃？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在30～
35℃？
答：温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。

20℃左右最适合酵母菌繁殖。

因此需要将温度控制在其
最适温度范围内。

而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35℃，因此要将温度控制在30～35℃。

4.制葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？
答：醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。

〔二〕［资料］发酵装置的设计讨论题
请分析此装置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。

为什么排气口要通过一个长而弯
曲的胶管与瓶身连接？结合果酒、果醋的制作原理，你认为应该如何使用这个发酵装置？
答：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出
料口是用来取样的。

排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的
污染。

使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。

五、查漏补缺
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专题二课题一微生物的实验室培养
1、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

⑴培养基按照物理性质可分为液体培养基〔主要用于工业生产〕、半固体培养基〔观察细菌运动、
1.．．．．
鉴别菌种〕和固体培养基〔主要用于菌种的别离、计数、鉴别〕。

在液体培养基中参加凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。

微生物在固体培养基外表生长，可以形成肉眼可见的菌落。

菌落是菌种鉴定
的重要依据。

⑵按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴别培养基。

⑶培养基的化学成分包括：水、无机盐、碳源、氮源、〔生长因子〕等。

无机碳源不能为微生物提供能量；
含碳有机物是异养型微生物的碳源和能源；
无机氮源NH3既是硝化细菌的氮源，也是其能源；N2是固氮菌〔如根瘤菌〕的氮源。

2、无菌技术：获得纯洁培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

③为防止周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应防止已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

3、消毒与灭菌的区别
⑴消毒：指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体外表或内部一局部微生物〔不包括芽孢和
孢子〕。

消毒常用煮沸消毒法、巴氏消毒法〔对于一些不耐高温的液体〕、化学药剂消毒、紫外线消毒。

⑵灭菌：那么是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

灭菌方法
有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

⑶灭菌方法：
①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；
②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；
③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。

4〕消毒与灭菌的共同点：①都需借助理化性质营造微生物难以生存的不良环境；②其作用原理都是通过使蛋白质变性来抑制微生物的生命活动或杀死微生物。

4、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
⑴方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。

①称量：牛肉膏黏稠，用称量纸称取；牛肉膏、蛋白胨易吸潮，称取要快、加盖。

②溶化：牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂→补水定容→调pH。

思考：溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?
答：可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差
③倒平板：待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

【教材答案】
无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
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答：还能有效防止操作者自身被微生物感染。

培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。

你用什么方法来估计培养基的温度？答：可以
用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平
板了。

为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基外表的湿度也比较高，将平板倒置，既可以
使培养基外表的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？
为什么？
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

5、纯化大肠杆菌
⑴微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

⑵平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基外表连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
到培养基的外表。

在数次划线后培养，可以别离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体〔菌
落〕。

⑶稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固
体培养基的外表，进行培养。

分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

⑷用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而
能在培养基外表形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

⑸平板划线法操作步骤：详见教材
⑹平板划线操作的讨论：为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作
结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为
了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。

划线结束后灼烧接种环，能及
时杀死接种环上残留的菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。

⑺稀释涂布平板法中涂布平板操作的步骤：
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。

②取少量菌液，滴加到培养基外表。

③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。

④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基外表。

〔8〕平板划线法与稀释涂布平板法各自的优缺点是什么？
①共同点：都能使细菌纯化；
②不同点：平板划线法不易别离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落别离，便
于计数。

③优缺点：稀释涂布平板法统计样品中的数目往往比实际数目低，这是因为当两个或多个细胞
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连在一起时，平板观察到的只是一个菌落。

6、菌种培养
将接种后的培养基和一个未接种的培养基〔起对照作用〕一起放入37℃恒温箱中培养，分别观
察并记录结果。

7、菌种的保存
⑴对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

〔于4℃的冰箱中保藏。

缺点：这种方法保存
的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

〕
⑵对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

〔菌液与甘油充分混匀后放在-20℃的冷
冻箱中保存。

〕
8、查漏补缺
专题二课题二土壤中分解尿素的细菌的别离与计数
（一、课题背景
尿素---是一种重要的农业氮肥，但尿素不能直接被农作物吸收。

只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。

土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。

二、筛选菌株〔1〕实验室中微生物的筛选应用的原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件〔包括营养、温度、pH等〕，同时抑制或阻止其他微生物生
长。

2〕选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，
称作选择培养基。

参加青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长；
不加含碳有机物的无碳培养基：别离自养型微生物；
参加高浓度的食盐的培养基：可选择培养金黄色葡萄球菌等。

三、统计菌落数目
1〕测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。

2〕显微镜直接计数法缺点:不能区分死菌与活菌.
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2
【例】每一个大方格边长为1mm，那么每一大方格的面积为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻
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片之间的高度为，所以计数室的容积为。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数是多少?1ml
菌液中的总菌数
33 ?(1ml=1cm=1000mm〕
【答案】5A5AB×104
〔3〕稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目〔又叫间接计数法或活菌计数法〕
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基外表生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个
活菌。

②公式：每mL样品中的菌株数=〔C÷V〕×M；C代表计数的平均菌落数，V代表涂布平板时所
用的稀释液体积，M代表稀释倍数。

③为了保证结果准确，一般设置3～5个平板〔至少3个〕，选择菌落数在30～300的平板进行
计数，并取平均值。

④缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。

因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

四、设置对照
设置对照的主要目的是:排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

五、实验设计
〔1〕土壤取样：从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。

铲去表层土3cm左右，在距地表约3～
8cm的土壤层取样。

〔2〕制备培养基：分别配置牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基。

〔牛肉膏蛋白
胨培养基作为对照,用来判断选择培养基是否起到了选择作用〕
〔3〕样品的稀释和涂布：在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌
落数在30~300之间、适于计数的平板。

①测定土壤中细菌的数量，一般选用456
10、10、10倍的稀释液进行平板培养；
．．
②测定放线菌的数量，一般选用103、104、105倍的稀释液进行平板培养；
．．．
③测定真菌的数量，一般选用102、103、104倍的稀释液进行平板培养；
．．
〔4〕微生物的培养:不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

①细菌30~37℃1~2天
②放线菌25~28℃5~7天
③霉菌25~28℃3~4天
(5)计数：每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因
培养时间缺乏而导致遗漏菌落的数目。

六、操作提示
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⑴取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

⑵应在火焰旁称取土壤10g。

将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。

⑶在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

⑷实验时要对培养皿作好标记。

注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

⑸为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。

七、菌种鉴定
在细菌分解尿素的化学反响中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。

氨会使培养基的碱性增强，
PH升高。

因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反响是否发生。

在以尿素为唯一氮
源的培养基中参加酚红指示剂。

培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

八、查漏补缺
专题三课题一菊花的组织培养
5一、植物组织培养的概念
1、概念：植物的组织培养又叫离体培养，是指在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织或细
胞，并使其生长、增殖、分化以及再生出植株的技术。

2、植物组织培养的原理：植物细胞的全能性。

3、细胞全能性的概念：指已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能。

4、细胞具有全能性的原因：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发
育成为完整个体所必需的全部基因.
二、植物组织培养的根底知识
1、细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。

细胞分化过程中遗传物质没有改变，其实质是基因选择性表达。

2、愈伤组织：细胞排列疏松而无规那么，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。

3、由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。

4、脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。

、植物组织培养的过程：
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三、影响植物组织培养的因素
1、外植体选取：
〔1〕不同的植物组织，培养的难易程度差异很大。

容易无性繁殖的植物，容易进行组织培养。

2〕植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。

3〕菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。

2、培养基的营养成分：
〔1〕植物组织培养常用的培养基是MS培养基。

〔2〕MS培养基的主要成分：
①大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S；
②微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co；
③有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等；
④植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等；
〔3〕各种营养物质的作用：
微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的
渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞对特殊营养的需求。

〔4〕同微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？
【答】微生物培养基以有机营养为主，MS培养基那么需提供大量无机营养。

3、植物激素：
〔1〕植物组织培养的关键性激素是生长素和细胞分裂素。

〔2〕在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。

〔3〕生长素和细胞分裂素的使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。

使用顺序实验结果
先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化
先使用细胞分裂素，后使用生长素细胞既分裂也分化
同时使用分化频率提高
生长素／细胞分裂素比值与结果
比值高时促根分化，抑芽形成
比值低时促芽分化，抑根形成
比值适中促进愈伤组织生长
〔4〕植物组织培养至少使用三种培养基：脱分化培养基、生芽培养基、生根培养基。

4、PH、温度、光等环境条件：
不同的植物对各种条件的要求往往不同。

进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5～8左右，
温度控制在18～22℃，并且每日用日光灯照射12h.
四、实验操作
⑴配制MS固体培养基：
①配制各种母液：大量元素浓缩10倍、微量元素浓缩 100倍、用量较小的有机物一般按1mg/ml 的质量浓度单独配置成母液。

使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。

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②配制培养基：在菊花组织培养中，可以不添加植物激素，因菊花茎段组织培养比较容易。

③灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

⑵外植体的消毒：
流水冲洗——少许洗衣粉——软刷刷洗——流水冲洗20分钟——无菌纸吸干—70%酒精摇动2~3次——无菌水冲洗——无菌纸吸干——0.1%氯化汞1~2分钟——无菌水冲洗至少三次，漂净消毒液
⑶接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，不要倒插。

每个锥形瓶接种6～8个外植体。

外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。

⑷培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度〔18～22℃〕和光照〔12h〕
⑸移栽：栽前应先翻开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。

然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。

最后进行露天栽培。

⑹栽培
五：外植体在培养过程中被污染的可能原因：
⑴外植体消毒不彻底；⑵培养基灭菌不彻底；⑶接种中被杂菌污染；⑷锥形瓶密封性差等。

六、查漏补缺
专题四课题一果胶酶在果汁生产中的作用
一、酶的根底知识
1、酶的概念：酶是活细胞所产生的具有生物催化作用的一类特殊的有机物；
2、酶的本质：蛋白质〔大多数〕或RNA；酶的组成单位：氨基酸或核糖核苷酸；
3、酶的功能及原因：酶具有催化作用，因为酶能降低化学反响的活化能。

4、酶的特性：高效性、专一性、需要适宜的条件
二、果胶和果胶酶
1、制作果汁要解决两个主要问题：一是果肉的出汁率低，耗时长；二是榨取的果汁浑浊、黏度高，
容易发生沉淀。

人们使用果胶酶、纤维素酶等来解决上述问题。

2、果胶：是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，不溶于水，在果汁加工中，既影响出汁率，又使果汁浑浊。

3、果胶的根本组成单位〔单体〕：半乳糖醛酸。

4、果胶酶的作用：将果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，瓦解植物的细胞壁及胞间层，并且使果汁
变得澄清。

5、果胶酶是一类酶总称，包括果胶分解酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶等。

6、产生果胶酶的生物：植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶；
【小贴士】由于原核生物的细胞壁的主要成分是肽聚糖，真菌细胞壁的主要成分是几丁质，因此这
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两类生物的细胞壁均不能用纤维素酶和果胶酶除去。

三、酶的活性与影响酶活性的因素
1、酶的活性：是指酶催化一定化学反响的的能力；酶活性的上下可以用反响速度来表示。

2、酶反响速度：用单位时间内、单位体积中反响物的减小量或产物的增加量来表示。

3、影响酶活性的因素：温度、PH、酶的抑制剂等；当酶处于最适温度或最适pH时，酶的活性最高；假设温度过高、过酸或过碱，那么导致酶变性失活。

四、实验设计---探究温度对酶活性的影响
①此实验的自变量是温度；根据单一变量原那么，应确保各实验组相同的变量有PH、底物浓度底物
量、实验器材、酶的用量等等
②果胶酶的最适温度为45～50℃，设置温度时，要以45～50℃为中心设置温度梯度,例30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃。

③为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将苹果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理？
【答】将苹果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理,可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的,防止了苹果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度,从而影响果胶酶活性的问题。

④果胶酶的活性是通过相同反响时间内产生的果汁的体积来表达的。

〔因为：在一定范围内，果肉的出汁率和果汁的澄清度与果胶酶的活性成正比〕
五、查漏补缺
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专题五课题3血红蛋白的提取和别离
一、根底知识
〔一〕凝胶色谱法
1、凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量大小别离蛋白质的有效方法。

2、凝胶是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。

3、凝胶小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以别离。

〔二〕缓冲溶液
1、缓冲溶液的作用：能够抵抗外界酸或碱对溶液PH的影响，维持PH根本不变。

2、缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成的，如NaH2PO4/Na2HPO4。

3、生物体内进行的各种生物化学反响都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的根本一致。

凝胶色谱法中缓冲溶液用于维持蛋白质的状态，凝胶电泳法中缓冲溶液使蛋白质带上电荷。

〔三〕电泳
1、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2、在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

3、电泳利用了待别离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的别离。

4、两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在凝胶中参加SDS，电泳速率完全取决于分子大小，因此，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5、聚丙烯酰胺凝胶---由单体丙烯酰胺和交联剂N,N`-亚甲基双丙烯酰胺聚合而成，蛋白质在聚丙烯
酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。

6、SDS的作用：使蛋白质完全变性并解聚成单条肽链，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质自身
电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异。

7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：电泳迁移率完全取决于分子的大小。

二、实验操作
蛋白质的提取和别离一般分为四步：样品处理、粗别离、纯化和纯度鉴定。

〔一〕样品处理
1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白〔血浆蛋白〕。

①采集血样、加抗凝剂柠檬酸钠；
②低速短时间离心〔500r/min、2min〕；【目的：防止白细胞等一同沉淀，达不到别离效果】
③吸出上层黄色血浆，将下层暗红色的红细胞倒入烧杯，再参加五倍体积的生理盐水〔质量分数为0.9%〕，缓慢搅拌10min；
低速短时间离心，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，说明红细胞已洗涤干净。

2、血红蛋白的释放：添加蒸馏水和甲苯〔溶解细胞膜〕，充分搅拌，使红细胞破裂释放出血红蛋白。

3、别离血红蛋白溶液：高速长时间离心〔2000r/min、10min〕，试管中的溶液分为4层。

第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明的血红蛋白水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。

将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于
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