膝关节骨关节炎滑液中关节磨粒的铁谱分析

膝关节骨关节炎滑液中关节磨粒的铁谱分析
李琳;胡鸿鹏;刘勃;马文辉
【摘要】目的对膝关节骨关节炎患者关节滑液中的磨粒进行铁谱分析,以早期评价骨关节炎的病情.方法将 368 例疑为骨关节炎患者根据Kellgren-Lawrence(K-L)分级分为正常关节组46 例和骨关节炎组 322 例,无菌抽取关节液,将其沉淀物磁化处理后,在铁谱显微镜下观察磨粒形态,对比正常关节组和骨节炎组以及骨节炎组不同分级的磨粒的长度、面积、伸长率和熵.结果骨关节炎组磨粒的长度、面积、伸长率和熵均明显大于正常关节组,差异有统计学意义(P＜0.05);骨关节炎组不同分级随着分级的升高其磨粒的长度、面积和伸长率逐渐减小,熵逐渐升高,差异均有统计学意义(P＜0.05 );磨粒长度与分级和熵呈正相关,与磨粒面积和伸长率呈负相关(P＜0.05).结论磨粒的形态和数量与关节磨损的速率和机制相关.磨粒的研究具有较高的敏感性和客观性,为骨关节炎的早期诊断提供了一种可靠选择.%Objective To perform ferrography analysis of wear debris in synovial fluid of patients with knee osteoarthritis and to make an early evaluation of the condition of osteoarthritis. Methods Three hundreds and sixty-eight patients with suspected knee osteoarthritis were collected and divided into the normal group(46 cases)and the osteoarthritis group(322 cases) according to Kellgren-Lawrence(K-L)classification.After aseptically extracting the joint fluid and magnetizing its sediment,the morphology of the abrasive particles was observed under the ferrography microscope.The
length,area,elongation and entropy of abrasive particles were compared between normal group and osteoarthritis group.Results The
length,area,elongation and entropy of abrasive particles in the
osteoarthritis group were significantly higher than those in the normal control group,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The abrasive particle length was positively correlated with the grading and entropy,the abrasive particle length was negatively correlated with the abrasive particle area and elongation rate (P＜ 0.05 ). Conclusion The shape and quantity of abrasive particles are related to the rate and mechanism of j oint wear.The study of abrasive particles has high sensitivity and obj ectivity,which provides a reliable choice for the early diagnosis of osteoarthritis.
【期刊名称】《河北医科大学学报》
【年(卷),期】2018(039)007
【总页数】6页(P796-800,832)
【关键词】骨关节炎;铁谱;磨粒;滑液
【作者】李琳;胡鸿鹏;刘勃;马文辉
【作者单位】河北医科大学第三医院骨病科,河北石家庄 050051;河北医科大学第三医院骨病科,河北石家庄 050051;河北医科大学第三医院骨病科,河北石家庄050051;河北医科大学第三医院骨病科,河北石家庄 050051
【正文语种】中文
【中图分类】R684.3
骨关节炎是以关节软骨破坏为特征的退行性疾病，膝关节骨关节炎占所有骨关节炎
的83%左右。

关节软骨的进行性破坏导致关节间隙变窄、疼痛、关节僵硬以及功
能受限，最终需要进行关节置换手术。

据统计，美国2010年因膝关节骨关节炎而行关节置换的患者约为30万例，预计到2030年可达到每年348万例[1-2]。

骨
关节炎发病机制尚不清楚，通常认为是力学、细胞学、遗传免疫学等多种因素综合作用的结果[3-4]。

X线是目前骨关节炎常用诊断方法。

但骨关节炎的病程可能会
长达数年甚至数十年，X线并不能检查到关节出现症状之前所发生的一系列组织改变[5-8]。

虽然磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)可以在一定程度上提高骨关节炎的诊断率，但是与关节镜相比，其对软骨退变的分辨率较为有限[9-10]。

目前，关节镜仍是诊断和评价骨关节炎“金标准”[11]。

由于关节镜是一种
有创的操作，故其通常只用于需要膝关节手术的患者，在临床的实际应用中有一定局限性。

近年来，许多研究试图通过生化标记物帮助检测骨关节炎[12-16]。

然而，许多细胞因子特异性差，目前尚未发现针对骨关节炎的特异性标记物。

临床医生们一直致力于寻找一种检测早期骨关节炎的实用的、微创的方法。

滑膜关节运动时会发生摩擦，从而产生特有的磨损颗粒。

磨损颗粒中会包含评价骨关节炎的有用信息，可以在发生X线改变之前用于骨关节炎的早期诊断和评价。

铁谱技术是工业上通
过磁化从润滑液中分离磨粒的方法。

利用偏振光显微镜和扫描电镜可以对磨粒特征进行分析和描述。

Evans等[17-19]最早使用铁谱技术对人类滑液中的磨粒进行了
分析。

但是，早期的磨粒研究是基于主观分析，研究者的经验对分析结果影响较大[20-21]。

因此，本研究在前人研究的基础上优化了谱片的制作技术，为磨粒分析
提供了前提保障，进一步筛选了磨粒的主要特征参数并结合能谱分析技术，从而提高了磨粒分析的可靠性和准确性。

另外，磨粒图像的自动提取和分割技术的应用也有助于获取准确的关节磨损信息。

报告如下。

1 资料与方法
1.1 一般资料选择2016年7月—2017年10月在我院就诊的疑为骨关节炎患者
368例，排除膝关节内骨折的患者。

患者均进行膝关节的X线评估，并通过关节
镜对其软骨情况进行评价。

按X线评估分为：正常关节组46例，男性19例，女
性27例，年龄24～78岁，平均(45.1±11.2)岁，体重指数17.5～34.2，平均23.7±3.2；骨关节炎组322例，男性148例，女性174例，年龄21～77岁，平均(48.4±13.4)岁，体重指数 18.2～35.7，平均25.6±4.7。

2组性别、年龄、体重指数差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

根据Kellgren-Lawrence(K-L)分级，骨关节炎患者又分为1级81例，2级72例，3级86例，4级83例。

见表1。

本研究经我院伦理委员会同意；参与本研究的患者均签署知情同意书。

表1 骨关节炎的K-L分级Table 1 Grading scales for the K-L radiographic osteoarthritis classification systems分级特征0正常1关节间隙可疑变窄，可
能有骨赘2有明显的骨赘，关节间隙轻度变窄3中等量骨赘，关节间隙变窄较明确，软骨下骨骨质轻度硬化改变，范围小4大量骨赘形成，可波及软骨面，关节
间隙明显变窄，硬化改变极为明显，关节肥大及明显畸形
1.2 关节液穿刺在进行关节镜手术之前，使用无菌穿刺针对每个膝关节进行穿刺，抽取滑液2 mL。

将滑液样本注入试管与3 mL 0.9%的生理盐水混合后以6 000
r/min的速度离心10 min，去掉上清液。

使用3 mL 0.9%的生理盐水将含有关节磨粒的沉淀物反复冲洗2遍，去掉上清液，在底层沉淀物中加入20 U的透明质酸酶，在37 ℃的条件下消化1 h，以去除凝结物质而不影响关节软骨。

然后使用
0.9%的生理盐水反复冲洗3遍，将底层沉淀的磨粒用于进一步的磁化处理。

1.3 磨粒的铁谱分析本研究所使用的磁化液中包含有氯化铒(磁化颗粒)、油酸(表
面活性剂)和乙醇(分散剂)。

将浓度为50 ppm的磁化液与磨粒按1∶1的比例混合，在65 ℃的条件下静置1 h。

将磁化液倒在磁化仪上，磁化的磨粒会按照大小沉淀
在玻璃谱片上。

将每张谱片在铁谱显微镜(Yatai FX-4,China)及扫描电镜(HITACHI
S-4800,Japan)下进行观察。

应用能谱仪(INCA-356,England)进一步分析磨粒的
成分。

然后，每张谱片随机选取5个磨粒进行特征分析。

应用等焦距影像传感器
捕捉颗粒的影像，并通过计算机影像处理系统进行分析。

提取磨粒的主要形态和纹理特征，包括：长度、面积、伸长率以及熵。

1.4 统计学方法应用SAS 9.1统计软件处理数据。

计量资料比较采用独立样本的t 检验、单因素方差分析和SNK-q检验；相关性采用Pearson相关性分析。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 磨粒形态表现通过铁谱显微镜和扫描电镜对关节磨粒进行观察，可将磨粒分
为3种形态，即软骨磨粒、骨磨粒和纤维磨粒。

纤维磨粒为较透明的条带样(图1)，而骨磨粒和软骨磨粒形状多样，主要有片状、杆状、块状(图2～5)，具有比较复
杂的边界轮廓。

图1 铁谱显微镜下可见纤维磨粒呈透明的条带状( ×400)
Figure 1 A transparent strip of fiber abrasive grains is visible under the ferrography microscope( ×400)
图2 铁谱显微镜下可见来自正常关节的薄片状磨粒( ×400)
Figure 2 Thin flake grains from normal joints are visible under the ferrography microscope( ×400)
图3 铁谱显微镜下可见主要来自1级骨关节炎的杆状磨粒( ×400)
Figure 3 The rod-shaped grains, mainly from 1-stage osteoarthritis, are visible under the ferrography microscope ( ×400)
图4 铁谱显微镜下可见来自更深层关节软骨的块状磨粒( ×400)
Figure 4 The massive grains from the deeper articular cartilage are visible
under the ferrography microscope( ×400)
图5 铁谱显微镜下观察到的骨磨粒( ×400)
Figure 5 Bone grains can be observed under the ferrography microscope( ×400)
2.2 正常关节组与骨关节炎组关节磨粒参数比较骨关节炎组磨粒的长度、面积、伸长率和熵均明显大于正常关键组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 正常关节组与骨关节炎组磨粒参数比较Table 2 Parameter analysis of wear particles between healthy and osteoarthritic knee joints
组别例数长度(μm)面积(μm2)伸长率(%)熵正常关节组
4628．63±1．82438．10±5．153．55±0．016．44±0．01骨关节炎组32249．36±3．361055．36±12．354．13±0．186．80±1．08t40．962334．535367．9692．258P0．0000．0000．0000．025
2级、3级和4级磨粒长度短于1级磨粒，3级和4级磨粒短于2级(P<0.05)；2级、3级和4级磨粒面积小于1级，3级和4级磨粒面积小于2级，4级磨粒面积小于3级(P<0.05)；3级、4级磨粒伸长率和熵高于1级、2级，4级高于3级(P<0.05)。

见表3。

2.3 相关性分析磨粒长度与分级和熵呈正相关，与磨粒面积和伸长率呈负相关(P<0.05),见表4。

表3 骨关节炎不同分级磨粒参数比较Table 3 Comparison of articular wear particles in different grades of patients
分级例数长度(μm)面积(μm2)伸长率(%)熵
18156．71±3．681195．00±13．454．19±0．356．55±2．01 27244．23±2．82∗1181．00±11．12∗4．18±0．286．53±2．01 38641．12±3．21∗#971．50±14．28∗#4．09±0．01∗#6．77±3．01∗#
48341．12±4．21∗#886．30±10．35∗#△4．01±0．01∗#△7．22±4．01∗#△ F360．3031350．95811．911658．428P0．0000．0000．0000．000
*P<0.05与1级比较 #P<0.05与2级比较△P<0.05与3级比较(SNK-q检验)
表4 磨粒长度与相关数据的相关分析Table 4 Correlation analysis of grain length and related data变量磨粒长度rP分级 0．3120．001 磨粒面积-0．5540．001 伸长率 -0．1650．015 熵 0．5150．001
3 讨论
骨关节炎是以软骨和软骨下骨退变为特征的，关节滑液中会有大量磨粒。

正常关节的关节软骨处于合成和降解的动态平衡中。

但关节软骨的修复能力非常有限，一旦关节软骨遭受损伤，绝大多数情况下其结构、功能、生物力学特性很难完全恢复，损伤的关节软骨会趋于退变[22-24]。

关节软骨能够降低摩擦和缓冲关节应力，从
而有助于滑膜关节的平顺活动。

关节软骨的破坏会明显加速关节磨损，产生大量磨粒聚集在关节滑液中，并进一步加重关节磨损，从而导致加剧关节退变的恶性循环。

关节滑液中磨粒的形态和数量与关节磨损的状态、速率和机制有关。

因此，关节滑液的磨粒分析可能是一种早期诊断骨关节炎和评价其病情进展状况的有效方法，并且根据关节的磨损机制，有助于进一步指导骨关节炎的防治。

铁谱显微镜下磨粒有3种形态，即软骨磨粒、骨磨粒和纤维磨粒，其形态与软骨的破坏程度有关，膝关节磨粒的能谱分析结果显示，骨磨粒中含有丰富的钙和磷元素，但软骨磨粒中基本不含此2种元素，而含有较高的硫和钠元素，它们是软骨基质的主要成分，纤维
磨粒中主要包含碳、氧和氯元素。

成熟的关节软骨组织呈带状构成，从软骨表面向深层依次可分为浅表层、过度或中间层、深层或放射层以及钙化层[25-26]。

在正常软骨表面，有一薄层具有高度延
展性的组织，可使关节在压力作用下沿表面滑动。

因此，只要这层组织保持完整和牢固，关节的磨损状态就是正常的。

此时关节软骨表面摩擦产生的磨粒呈现为薄的、
光滑的、片状的简单形状。

本研究中正常关节的磨粒形态参数分析结果已证实了这一现象。

与骨关节炎磨粒相比，正常关节磨粒的长度、面积以及伸展性均较小，并且反映磨粒复杂程度的熵值也更低。

在关节运动过程中，反复挤压会导致关节软骨浅表层和中间层之间错位，并且在接触疲劳应力影响下会产生细微的裂缝。

随着应力的反复作用，这些细微裂缝会逐渐延伸，甚至导致表层碎裂，从而形成片状或杆状磨粒。

正常情况下，细微裂缝邻近浅表层，之后通过类似于布朗运动的随机过程逐渐延伸。

如果软骨破坏比较表浅，表明骨关节炎处于1级或2级。

本研究结果
显示，此阶段产生的磨粒比正常关节磨粒的形态更复杂，其熵值也更高。

随着关节磨损的进展，关节软骨的浅表层和中间层之间会发生严重的塑性变形。

于是，裂缝会迅速延伸并导致表层的大面积剥落。

这时的磨粒更大，并且具有更加不规则的边界和粗糙的表面，进而会导致关节磨损的增加。

这表明病变已经侵及关节软骨的深层，此时的骨关节炎已达到3级。

本研究结果也显示3级骨关节炎磨粒的熵值明
显增高。

此后，由于大量具有复杂表面形态的磨粒在关节中聚集，关节软骨的磨损速率会显著增加，进而逐渐造成软骨深层的撕脱，最终显露出软骨下骨。

在交变切应力作用下，软骨下骨会出现裂缝并沿表面延伸，最后导致疲劳剥落形成骨性磨粒，这意味着关节病变已进展到4级。

本研究在4级骨关节炎的滑液中可找到骨性磨粒，其形态较软骨表层磨粒更复杂。

本研究较全面地揭示了膝关节的磨损机制，并对骨关节炎的发生和发展过程有了更深入的理解，有助于预测骨关节炎的进展和预后。

铁谱技术是一种从水性和非水性悬浮液中磁化收集和分类金属粒子的技术。

可用于分析人类关节滑液中的软骨和骨磨粒，以及软组织碎片。

由于铁谱技术是利用磁力收集磨粒并将它们按大小进行有序排列，故首先必须对生物材料进行磁化。

有报道称稀土金属铒的三价阳离子可用于非磁性材料的磁化[27]。

然而，非铁磁性粒子的磁化效果受多种因素影响，磁化效果欠佳会导致磨粒的分散和丢失。

因此，根据磁化原理，本研究对关节滑液的磁化过程进行了优化，结果证实磁化液的最佳浓
度为50 ppm，磁化液和磨粒样本液的最佳配比为1∶1或1∶2。

在此条件下，关节磨粒可有效地聚集在铁谱片上，从而在铁谱分析中获取更充分的磨粒信息。

另外，铁谱分析是通过影像处理技术来获取磨粒信息的。

但铁谱分析中常见的磨粒重叠问题会影响磨粒分离和诊断分析，从而难于提取单个磨粒的特征。

并且，由于背景图像的多变性，通常会导致铁谱片中所捕捉到的磨粒图像比较模糊。

因此，难于获得用于磨粒特征分析的可靠图像。

为了改善图像质量，本研究采用了磨粒铁谱图像的自动提取方法。

利用合成色距函数将彩色铁谱图像的三通道问题转化为单通道问题，从而简化了图像分割过程。

通过简化的脉冲耦合神经网络技术对铁谱图像进行间接分割，并利用数学形态学对所获得的二进制图像进行处理。

采用数学形态学的连通域提取算法自动提取典型的磨粒图像。

这种方法将数学形态学与脉冲耦合神经网络技术相结合，可以有效分割彩色铁谱图像，并且实现典型磨粒图像的自动提取。

在本研究中，对所提取的典型磨粒的形态特征参数进行了分析。

在这些参数中，熵值对于了解磨粒复杂性和不规则程度更有意义。

它与磨粒的复杂形态成正相关，可用于描述复杂磨粒的几何特征。

磨粒形态越复杂，其熵值越大。

本研究结果显示骨关节炎磨粒的熵值明显高于正常关节磨粒，磨粒分析的数据与K-L分级具有相关性。

表明这些特征参数对于磨粒形状的变化是比较敏感的，可以反映肉眼尚不能察觉的关节软骨的细微磨损。

因此，关节磨粒分析有可能是预测骨关节炎进展的一种新的、有前途的方法。

总之，本研究结果表明铁谱技术是一种评价膝关节磨损特征的有效方法。

它的敏感性和客观性均优于传统的关节镜检查。

铁谱分析的结果进一步证实了关节软骨的组织分层结构，并揭示了关节磨粒形态特征与骨关节炎严重程度之间的关系，为预测骨关节炎的进展提供了一种可靠选择。

本研究图像自动提取和分割技术可获取充足的磨粒信息，从而有助于进一步准确有效的特征分析。

由于本研究对铁谱数值参数分析和数字图像处理技术方面的知识有限，故其结果存在一定的局限性。

对于关节
磨粒分析这一新颖、有潜力的方法，尚有很多工作需要去做，如进一步优化图像的自动处理方法，以改善磨粒分割的准确性。

另外，需要加大各期骨关节炎患者的例数，以进一步提高关节磨粒分析结果的有效性。

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