一种快速高效的白桦转基因方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710283893.9
(22)申请日 2017.04.26
(71)申请人 东北林业大学
地址 150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和
兴路26号
(72)发明人 刘中原　高彩球　王玉成　张腾倩　
王培龙　唐绯绯　李亚博　王媛媛　
(74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事
务所 23109
代理人 侯静
(51)Int.Cl.
C12N 15/84(2006.01)
A01H 4/00(2006.01)
(54)发明名称
一种快速高效的白桦转基因方法
(57)摘要
一种快速高效的白桦转基因方法，它涉及一
种植物转基因的方法。

本发明的目的是要解决现
有白桦稳定转化效率低和转化周期太长的问题。

本发明的方案为：选取苗高为5～6cm的白桦组培
苗，诱导培养愈伤组织；转移至含目的基因序列
的根癌农杆菌侵染液中，抽真空处理后，暗培养；
进行抗性苗筛选，将筛选的抗性苗转移到加选择
剂和抑菌剂的生根培养基中培养，分子检测验证
成功后，即完成。

与现有技术相比，平均转化率提
高了2.71倍。

且用愈伤组织侵染转化周期比用叶
片和茎为外植体转化周期缩短1/3以上。

本发明
应用转基因领域。

权利要求书1页 说明书4页 附图4页CN 106884020 A 2017.06.23
C N 106884020
A
1.一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、选取苗高为5～6cm的白桦组培苗，在超净工作台中将外植体叶片和茎段置于愈伤诱导培养基中，诱导培养7～10天；
二、将步骤一在愈伤诱导培养基中生长的愈伤组织取出，转移至含目的基因序列的根癌农杆菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培养的培养基上，黑暗处理48h；其中，侵染液OD 600为0.6～0.8，
三、将步骤二黑暗处理后的愈伤组织置于加入抑菌剂的转基因抗性筛选培养基上于25℃光照条件下进行筛选培养40～50天，得到白桦抗性苗；
四、将步骤三的白桦抗性苗转移到加选择剂和抑菌剂的生根培养基中培养37～42天后，进行分子检测验证，检测验证正确后，即表明获得转基因白桦苗。

2.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤一中所述的生根培养基含WPM、0.2mg/L的NAA、30g/L的蔗糖和
3.0mg/L Phytagel，pH＝5.8。

3.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤一中所述的愈伤诱导培养基含WPM、0.8mg/L的6-BA、0.5mg/L的GA 3、0.02mg/L的NAA、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel，pH＝5.8。

4.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤二中所述的共培养的培养基含WPM、1.0mg/L的6-BA、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel，pH＝
5.8。

5.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤二中所述的侵染液含WPM、150μM的As、30g/L的蔗糖，pH＝5.8。

6.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤三中所述的筛选培养基含WPM、1.0mg/L的6-BA、30g/L的蔗糖、3.0mg/L的Phytagel、选择剂和抑制剂，pH＝5.8。

7.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于选择剂为30～50mg/L的卡那霉素，抑制剂为300～500mg/L的氨苄霉素。

8.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤四中所述的生根培养基含WPM、0.2mg/L的NAA、30g/L的蔗糖、3.0mg/L的Phytagel、选择剂和抑制剂，pH＝5.8。

9.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于选择剂为30～50mg/L的卡那霉素，抑制剂为300～500mg/L的氨苄霉素。

10.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤四选择的抗性苗株高为1.5～2.0cm。

权　利　要　求　书1/1页CN 106884020 A
一种快速高效的白桦转基因方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种植物转基因的方法。

背景技术
[0002]白桦(Betula platyphylla)是桦木属(Betula Linn)的一种落叶乔木。

在亚洲东部广布分布。

喜光，耐严寒，生命力极强，是恢复植被、保护森林水分和土壤的优良造林树种，同时又是一个重要的药用和纤维用优良经济树种。

但白桦传统育种周期长，遗传改良进程缓慢，不能按照育种目标改造性状来满足日益增长的社会需要。

而基因工程育种技术中，现有的白桦转基因主要是对外植体直接进行转化，由于白桦再生与转化所用外植体具组织特异性、转化周期漫长等常导致其转化效率较低。

此外，这些转化技术通常因为农杆菌的长期参与造成受体材料黄化严重，再生困难，这些成为制约白桦分子育种进程的“瓶颈”所在。

所以寻找一种快速、稳定、高效的遗传转化方法对白桦基因功能研究和遗传改良至关重要。

[0003]本实验的创新之处一是在白桦愈伤的基础上进行的农杆菌侵染转化，这样避免了直接使用外植体带来的转化时间长，转化效率低的困扰。

白桦外植体直接进行转化途径中从侵染的外植体到获得抗性芽需要2-3个月，使用白桦愈伤进行转化从外植体到获得抗性芽需要1个月左右，大大缩短了转化时间。

二是增加了负压(抽真空)处理的步骤，负压处理能能提高白桦稳定转化效率。

本发明创造性的使用白桦愈伤与首次在白桦中使用真空抽提技术相结合大大促进了白桦稳定转化的效率。

故优化后的白桦稳定转化体系能很大程度上提高转基因效率，缩短转基因时间。

发明内容
[0004]本发明是要解决现有白桦稳定转化效率低和转化周期太长的问题，为快速研究白桦基因功能、获得目标性状改良的转基因植株提供平台。

白桦遗传转化是对原有的白桦转化体系的完善。

[0005]本发明的一种快速高效的白桦转基因方法，它是按照以下步骤进行的：
[0006]一、选取苗高为5～6cm的白桦组培苗，在超净工作台中将外植体叶片和茎段置于愈伤诱导培养基中，诱导培养7～10天；
[0007]二、将步骤一在愈伤诱导培养基中生长的愈伤组织取出，转移至含目的基因序列的根癌农杆菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培养的培养基上，黑暗处理48h；其中，侵染液OD600为0.6～0.8，
[0008]三、将步骤二黑暗处理后的愈伤组织置于加入抑菌剂的转基因抗性筛选培养基上于25℃光照条件下进行筛选培养40～50天，得到白桦抗性苗；
[0009]四、将步骤三的白桦抗性苗转移到加选择剂和抑菌剂的生根培养基中培养37-42天后，进行分子检测验证，检测验证正确后，即表明获得转基因白桦苗。

[0010]本发明的有益效果：
[0011]本发明的方法通过选择适宜生理状态的白桦组培苗进行了诱导愈伤处理。

这种处
理方式避免了白桦外植体直接转化的周期长及白桦外植体的选择困难等问题。

(注：选择的白桦叶片过于幼嫩容易被农杆菌侵染，需要每天或隔天对叶片进行除菌，这种过于幼嫩的叶片很容易被菌包裹而死，不易获得转化后的抗性苗。

选择的白桦叶片过于衰老虽不易被农杆菌侵染，但是叶片分化愈伤组织能力差，也不易获得转化成功的抗性苗。

白桦的茎段也存在类似叶片的问题，但茎段最主要的问题是茎段带有芽点，会导致大量的假阳性苗产生，转化效率低。

在白桦愈伤组织的基础上应用真空泵抽真空5-10min的处理。

该处理能使含目的基因的侵染液和受体白桦的愈伤组织充分接触，能大大提高转化效率。

在以上因素的共同作用下能提高白桦稳定转化效率。

本发明在筛选和除菌的培养基上转移5次，共获得了19棵抗性芽，转化率为9.5％，与侵染白桦叶片相比，平均转化率提高了4.75倍；与直接侵染白桦外植体-茎段相比，平均转化率提高了3.8倍，与侵染白桦愈伤相比，平均转化率提高了2.71倍。

且用愈伤组织侵染转化周期比用叶片和茎为外植体转化周期缩短1/3以上。

附图说明
[0012]图1为实施例一中继代培养的白桦组培苗照片；
[0013]图2为实施例一中继代培养40天的白桦组培苗照片；
[0014]图3为实施例一中愈伤诱导培养基诱导后的愈伤组织照片；
[0015]图4为实施例一中愈伤诱导培养基诱导后的愈伤组织照片；
[0016]图5为实施例一中愈伤被目的基因侵染后筛选培养基上长出的白桦早期抗性不定芽照片；
[0017]图6为实施例一中愈伤组织在被目的基因侵染后筛选培养基上长出的白桦抗性不定芽丛生苗照片；
[0018]图7为实施例一中的加抗生素的生根培养基上的白桦抗性苗照片。

具体实施方式
[0019]具体实施方式一：本实施方式的一种快速高效的白桦转基因方法，它是按照以下步骤进行的：
[0020]一、选取苗高为5～6cm的白桦组培苗，在超净工作台中将外植体叶片和茎段置于愈伤诱导培养基中，诱导培养7～10天；
[0021]二、将步骤一在愈伤诱导培养基中生长的愈伤组织取出，转移至含目的基因序列的根癌农杆菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培养的培养基上，黑暗处理48h；其中，侵染液OD600为0.6～0.8，
[0022]三、将步骤二黑暗处理后的愈伤组织置于加入抑菌剂的转基因抗性筛选培养基上于25℃光照条件下进行筛选培养40～50天，得到白桦抗性苗；
[0023]四、将步骤三的白桦抗性苗转移到加选择剂和抑菌剂的生根培养基中培养37-42天后，进行分子检测验证，检测验证正确后，即表明获得转基因白桦苗。

[0024]具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的生根培养基含WPM(Woody Plant medium)、0.2mg/L的NAA(1-naphthylacetic acid)、30g/L的蔗糖和3.0mg/L Phytagel(结冷胶)，pH＝5.8。

其它与具体实施方式一相同。

[0025]具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的愈伤
诱导培养基含WPM(Woody Plant medium)、0.8mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、0.5mg/L的GA3(Gibberellic acid A3)、0.02mg/L的NAA(1-naphthylacetic acid)、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel(结冷胶)，pH＝5.8。

其它与具体实施方式一相同。

[0026]具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中所述的共培养的培养基含WPM(Woody Plant medium)、1.0mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel(结冷胶)，pH＝5.8。

其它与具体实施方式一相同。

[0027]具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中所述的侵染液含WPM(Woody Plant medium)、150μM的As(乙酰丁香酮，Acetosyringone)、30g/L的蔗糖，pH＝5.8。

其它与具体实施方式一相同。

[0028]具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中所述的筛选培养基含WPM(Woody Plant medium)、1.0mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、30g/L的蔗糖、3.0mg/L的Phytagel(结冷胶)，选择剂和抑制剂，pH＝5.8。

其它与具体实施方式一相同。

[0029]具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：选择剂为30～50mg/L 的卡那霉素，抑制剂为300～500mg/L的氨苄霉素。

其它与具体实施方式六相同。

[0030]具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中所述的生根培养基含WPM(Woody Plant medium)、0.2mg/L的NAA(1-naphthylacetic acid)、30g/L的蔗糖、3.0mg/L的Phytagel、选择剂和抑制剂，pH＝5.8。

其它与具体实施方式一相同。

[0031]具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是：选择剂为30～50mg/L 的卡那霉素，抑制剂为300～500mg/L的氨苄霉素。

其它与具体实施方式八相同。

[0032]具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四选择的抗性苗株高为1.5～2.0cm。

其它与具体实施方式一相同。

[0033]具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四进行分子检测验证的苗株株高为5～6cm。

其它与具体实施方式一相同。

[0034]本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

[0035]通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0036]实施例1
[0037]本实施例的白桦稳定转化方法，按以下步骤进行：
[0038]一、选取苗高为5-6cm的白桦组培苗，在超净工作台中将外植体叶片和茎段置于愈伤诱导培养基中，诱导培养7-10天。

(注：选择外置体-叶、茎时，应选择幼嫩、肥厚的叶片和粗壮的茎段。

)
[0039]二、将步骤一中愈伤诱导培养基中生长的愈伤组织取出迅速转移至加有含BpGRP 基因过表达载体pROKII-BpGRP1的根癌农杆菌侵染液中(侵染液农杆菌的OD600为0.6-0.8)。

置于真空泵中负压-0.1mpa抽真空5-10min，随后置于共培养的培养基上，28℃，黑暗处理48h。

(注：侵染后的愈伤组织不需要无菌水洗涤，直接转到共培养培养基上培养。

)其中侵染液的制备方法为，取50uL含pROKII-BpGRP1的根癌农杆菌加到10mL LB液体培养基中，28℃200rpm培养过夜，至OD600约0.6～0.8，然后从10mL菌液中取100uL菌液重新加入至50mL LB 液体培养基中，28℃200rpm培养至OD600为0.6～0.8后，置于常温离心机3000G离心，去上清，加入等体积的重悬液(注：重悬液含WPM，30g/L蔗糖)重悬菌体。

[0040]三、将步骤二中黑暗处理后的愈伤组织移至含选择剂和抑菌剂的筛选培养基上置于28℃/25℃(白天/黑夜)，14h-光照/10h-黑暗，光强接近500mmol m-2s-1的温室中进行筛选培养(黑暗处理后的愈伤组织如有大量农杆菌滋生，需要用无菌水洗涤2-3次后用抑菌剂比如浓度为500mg/L Carbenicillin或者浓度为500mg/L Timentin水再次洗涤一遍，用无菌滤纸吸干水分转至筛选培养基中筛选培养。

如无大量农杆菌滋生则直接转入含选择剂(30mg/L Kanamycin)和抑菌剂(500mg/L Carbenicillin)的筛选培养基中筛选培养。

)，20天左右长出抗性不定芽，20-30天后抗性不定芽长到株高1.5-2.0cm抗性苗。

[0041]四、将步骤三中的株高1.5～2.0c m白桦抗性苗转移至加选择剂(50m g/L Kanamycin)和抑菌剂(300mg/L Carbenicillin)的生根培养基中，大约一个星期后产生不定根，30～35天后株高达5～6cm时进行分子检测验证。

检测验证正确后即表明获得转基因白桦苗。

[0042]本实施例中继代培养的白桦组培苗如图1和2所示。

图1为刚刚继代的白桦组培小苗，此时的白桦组培小苗还不能用于白桦的稳定转化；图2为继代40-45天后的白桦组培苗，此时的白桦组培苗可用于白桦的遗传转化；图3和图4为白桦的外植体-茎段和叶片在愈伤诱导培养基上培养10天后的状态；图5为白桦愈伤组织在被含BpGRP基因的过表达载体pROKII-BpGRP1杆菌侵染液侵染后，筛选培养基上生长15天的愈伤状态，此时开始有早期的抗性不定芽产生；图6为白桦愈伤组织在被含BpGRP基因的过表达载体pROKII-BpGRP1的侵染液侵染后，筛选培养基上生长20-30天后的状态，此时抗性不定芽已长至1-1.5cm；图7为将抗性丛生苗移植到含有选择剂和抑菌剂的生根培养基长大成苗。

[0043]实施例2
[0044]本实施例方案采用的是选取高度为5-6cm的白桦组培苗取第2或第3片健壮叶片用于农杆菌的侵染，再置于筛选培养基中筛选培养。

其它与实施例1相同。

[0045]本实施例为对照例。

[0046]实施例3
[0047]本实施例方案采用的是选取长势好，高度为5-6cm的白桦组培苗切成1-1.5cm长茎段用于农杆菌的侵染，再置于筛选培养基中筛选培养。

其它与实施例1相同。

[0048]本实施例为对照例。

[0049]实施例4
[0050]本实施例方案采用的是选取状态好的愈伤组织迅速转移至加有含BpGRP基因过表达载体pROKII-BpGRP1的根癌农杆菌侵染液中(侵染液OD600为0.6-0.8)进行侵染。

侵染完毕后置于共培养的培养基上，黑暗处理36h。

其它与实施例1相同。

[0051]本实施例为对照例。

[0052]通过实施例1与实施例2、3和4的对照例相比可知，实施例1在筛选和除菌的培养基上转移5次，共获得了19棵抗性芽，转化率为9.5％，与实施例2相比，平均转化率提高了4.75倍；与实施例3相比，平均转化率提高了3.8倍；与实施例4相比，平均转化率提高了2.71倍。

且用愈伤组织侵染转化周期比用叶片和茎为外植体转化周期缩短1/3以上。

图1
图2
图3
图4
图5
图6
图7。