DNA的提取

植物组织DNA的提取和鉴定
一、实验目的：
1、学习并掌握用CTAB法提取植物总DNA的原理和方法。

2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。

3、学习核酸染色的方法。

二、实验原理：
1、CTAB法提取植物总DNA
核酸在植物体内多与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在，因此提取分离核酸时，必须使核酸与蛋白质解离，并除去蛋白质和多糖等杂质。

本实验先将植物材料速冻、研磨，破碎细胞壁，然后加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）分离缓冲液，使细胞膜破裂，同时将核酸与蛋白质及多糖等杂质分开。

一定浓度的CTAB与核酸结合形成复合物，该复合物溶于高浓度的盐溶液，（而在低盐溶液中沉淀）再经氯仿－异戊醇抽提、离心，除去蛋白质等杂质，上清液中加入异丙醇，沉淀DNA，而CTAB溶于异丙醇。

2、脱氧核糖核酸（DNA）的分离鉴定
（1）电泳定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。

根据电泳支持介质的不同，可分为滤纸，醋酸纤维薄膜，淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

电泳技术的应用非常广泛，从分离小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定都依赖于电泳技术。

（2）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3,6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。

琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。

电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶（ethidium bromide，EB）指示DNA样品在凝胶中的确切位置。

溴乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发EB发出波长为590nm的红橙色荧光。

溴乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡，但小分子DNA浸泡时间过长容易引起扩散。

溴乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。

注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。

三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：三叶草、小麦幼苗
2、仪器：(1)电热恒温水浴锅；(2)离心机；(3)液氮罐；(4)研钵；（5）离心管；（6）移液管；（7）吸管；（8）稳压稳流电泳仪；（9）可调微量移液器；（10）水平电泳槽；（11）暗箱紫外透射仪等。

3、试剂：
（1）CTAB分离缓冲液：2%CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl (pH8.0),0.2%巯基乙醇共100ml；
（2）氯仿：异戊醇＝24：1；
（3）异丙醇；
（4）TE；
（5）95％乙醇溶液；
（6）80％乙醇溶液；
（7）缓冲液：10 mmol／LTris－HCI，lmmol／L EDTA，其中含RNA酶20ug／mL；
（8）电泳缓冲液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）；
（9）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB）40%蔗糖；
（10）溴化乙锭（EB）溶液：10μg/ml；
（11）琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。

四、实验步骤：
1、植物总DNA的提取
（1）、取10mlCTAB分离缓冲液加入离心试管中，于56℃水浴预热。

（2）、称取1.5g新鲜叶片于预冷的研钵中，加入液氮研磨细粉末。

（3）、将叶片粉末直接加入预热的CTAB分离液中，轻轻转动，混匀，56℃水浴保温30分钟。

（4）、加入等体积的氯仿－异戊醇，轻轻摇动，混匀，分装到两个离心管中，等重，4000r/min，离心10分钟。

（5）、用开口较大的滴管取出上层水相于另一离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，使DNA沉淀，并与CTAB分离。

（注意现象）
（6）、收集DNA：
如呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒（或小勺）轻轻搅起。

如呈云雾状，再2000r/min离心2min，小心倒去上清液。

（7）、洗涤：
将丝状DNA直接转移到15Ml的洗涤缓冲液中洗30分钟（如不能搅起，可2000r/min离心1－2分钟，转速不宜太高，否则形成坚实的沉淀）；
在松散的沉淀物上加入15ml洗涤液，洗涤30分钟，用玻璃棒轻轻搅起沉淀。

(8)、保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存备用。

2．琼脂糖凝胶电泳
（1）凝胶板的制备：a取琼脂糖0.7 g，加1×TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。

b胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。

c插入梳子，梳齿下端离板底－1mm。

d将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免气泡，室温下凝固。

e完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。

（2）加样：将样品DNA溶液与加样缓冲液以5 ：1的体积比混合，用微量进样器加样，每加完一个样品，冲洗三次。

加样量15～20 l （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部）。

（3）电泳：为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)，样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 。

当染料前沿移至底边1-2mm时，电泳毕。

（4）染色、观察、显微照相与记录：关闭电源，取出胶床，浸入μg/mL的EB溶液中，30min后取出。

在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA（红橙色荧光），并进行显微照相。

五、注意事项：
核酸提取过程中的注意事项：
1．避免过酸过碱或高温环境，合适的T：0－4℃，pH4-9；
2．防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；
3．防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂－EDTA，柠檬酸钠；
4．整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。

六、思考题：
用荧光染料EB染色的原理和优缺点是什么？
荧光染料EB染色的原理和优点是什么？
1、原理：
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)。

EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。

激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收254nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB 本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。

这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。

2、优点：
（1）染色比较简便、快捷，一般在10－15min就可反应。

（2）EB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做到的。

（3）EB灵敏度高，可检测出10ng或更少的DNA含量。

（4）既可用于DNA也可用于RNA的检测。

（5）EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外灯检测电泳的进程和效果。

（6）EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的EB强10倍，
因此不需洗净凝胶中游离的EB也可检测出DNA的条带。

3、缺点：
溴乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。

含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。

（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；
（2）室温下放置1小时，不时的摇动；
（3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。

*溴乙啶在260℃分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。