透明质酸钠的无菌检查

透明质酸钠的无菌检查

曲建全赵长美李国凤郭凤仙

随着研究的不断深入，透明质酸钠，在医药领域已经广泛应用，并具有较高临床价值。

药用透明质酸钠用于配制注射剂时，必须进行无菌检查，以保证用药安全。由于透明质酸钠的黏度大，不易溶解，结合中国药典无菌检查的有关规定，我们进行了试验摸索，并提出解决方法[1~4]，供参考。

1 实验仪器设备，用具，培养基及试剂

1.1 仪器设备

生化培养箱、100级净化工作台、台式恒温水浴振荡器、天平

1.2 用具

三角瓶（500ml）、试管（21×200）、硅胶塞、注射器和针头、称量勺、吸量管，均需115℃，30分钟高压灭菌后方可使用。

1.3 培养基

需气菌、厌气菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基），中国药品生物检定所监制，每个试管装15 ml，共需7支。真菌培养基，每个试管装15 ml，共需5支。此两种培养基均需经115℃，30分钟高压灭菌方可使用。

1.4 试剂

0.9%氯化钠溶液，玻璃酸酶（1500单位/支）30支，磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠2.5克，磷酸氢二钠1.0克，氯化钠8.2克，加水使成1000 ml）301ml 装入500 ml三角瓶中作溶解用水，除玻璃酸酶外其他试剂需经115℃，30分钟高压灭菌方可使用。

1.5金黄色葡萄球菌菌液用0.9%氯化钠溶液稀释至每1ml含10～100个菌。

2 实验步骤

2.1 供试液制备

在无菌条件下，用带针头的注射器把30支玻璃酸酶加入到301ml无菌磷酸盐缓冲液中，混匀后用吸量管吸取1ml加入到1个需气菌、厌气菌培养基试管中，作阴性对照。然后再用天平称取3.0克注射级透明质酸钠加入到剩余的300ml磷酸盐缓冲液中，密封好瓶塞后，放在水温为42℃台式恒温振荡器中振荡至透明质酸钠完全溶解（1小时左右），制成浓度为1%的透明质酸钠溶液。

2.2 操作方法

在无菌条件下，用吸量管各吸取上述供试液1ml，分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管中，其中1管再接种金黄色葡萄球菌菌液1ml，作阳性对照；另各吸取1ml供试液分别接种于真菌培养基5管中，接种后轻轻摇动，使混匀。

2.3培养并观察

需气菌、厌气菌培养基管置30～35℃，真菌培养基管置20～25℃的生化培养箱中，连续培养7日，每日观察并记录各管是否有菌生长。7日后，如不能从外观上判断有无菌生长，可用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。

3 结果判断

3.1 当阳性对照管显浑浊并在开始培养的24小时内就有菌生长，阴性管对照呈阴性，其他需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或有的管显浑浊但经证明并非有菌生长，则判供试品为合格。

3.2 如上述供试液培养管除阳性外其他任何1管显浑浊并确证有菌生长，应重

新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性管外其他各管均不得有菌生长，否则判供试品不合格。

4 讨论

4.1 透明质酸钠属于高分子物质，黏度大，样品溶解不匀或时间过长均会直接影响无菌检查结果，为此我们进行试验摸索溶解时加入45000单位玻璃酸酶可以控制其1小时左右溶解。

4.2 透明质酸钠制成药用注射剂时通常制成1%的2 ml/支的溶液，所以实验中我们把供试液浓度也制成1%，参考中国药典2 ml装量的样品，每管接种量是半量即1 ml，所以我们每管培养基也接种1 ml供试液。

4.3对于需气菌、厌气菌培养基，供试液接种前，培养基指示剂氧化层的颜色不得超过试管1/5，否则须经水溶煮沸，只限加热一次。另外，注入供试液时切勿向液面直射，以免将空气中的氧带入培养基而使指示剂氧化层加大。

4.4对于加有抑菌剂的供试品，应在培养基中加入相应种类及数量的中和剂，消除抑菌性后，再作无菌检查。

参考文献

1凌沛学．透明质酸．北京：中国轻工业出版社，2000，（8）,46～49

2凌沛学．玻璃酸钠及其在外科中的应用．北京：中国医药科技出版社，2003,57～60

3林元藻,王凤山,等．生化制药学．北京：人民卫生出版社，1986,211～213,255～256

4国家药典委员会．中国药典2000版二部．附录89～92

[原文发表于：2003年全国生化与生物技术药物学术研讨论文集，丹东，2003，

192～193]