课题2--三维设计

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数对应学生用书1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)同时抑制或阻止其他微生物的生长。

2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

3．测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。

稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌数目低。

4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。

5．鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，据是否变红进行判断。

1．筛选菌株的思路(1)自然界中目的菌株的筛选：①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选：①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a．选择培养基：允许特定微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。

2．统计菌落数目(1)常用方法：稀释涂布平板法。

①原理⎩⎪⎪⎪⎨⎪⎪⎪⎧ a.当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌b.通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数②计算公式：每克样品中的菌株数＝C .V .M 。

C ：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V ：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M ：代表稀释倍数。

③注意事项：a ．为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。

b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。

原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

c．设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)其他方法：利用显微镜直接计数。

1．阅读教材P22第一段旁栏中的相关内容，并思考回答下列问题：(1)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？琼脂的作用是什么？提示：碳源主要是葡萄糖，氮源是尿素。

琼脂的作用是作为凝固剂。

(2)该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？提示：该培养基对微生物有选择作用。

该培养基的氮源比较特殊，是尿素，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。

(3)该培养基属于何种类型？提示：该培养基属于固体培养基，又属于选择培养基。

2．教材中P22楷体字部分所列举的两位同学对菌落数的统计，哪位同学的结果更接近真实值？提示：第一位同学只涂布了一个平板，没有设臵重复组，因此结果不具有说服力。

第二位同学考虑到设臵重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

1．选择培养基的选择作用(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法：①在培养基中加入某种化学物质。

例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

②改变培养基中的营养成分。

例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。

③改变微生物的培养条件。

例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。

2．显微镜直接计数法(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用计数板计数。

计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。

如下图所示。

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

[特别提醒]显微镜直接计数的操作步骤①取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖盖玻片。

②取菌液，摇匀，用滴管吸取菌液在盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。

③用显微镜10×物镜观察并将计数室移至视野中央。

④在10×物镜下计数：计数5个(或4个)中格的总菌数，然后求得每个中格的菌数的平均值，再乘以16(或25)就得出计数区的总菌数，最后再换算出每毫升菌液中的含菌数。

⑤注意事项：在计数边线上的细菌时计上不计下，计左不计右。

3．直接计数法与间接计数法的比较微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。

二者比较如下：1．实验设计2．操作提示(1)无菌操作：①取土样的用具在使用前都需要灭菌。

②应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。

为避免混淆，最好使用前就做好标记。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率。

3．菌种鉴定(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

1．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？当第一次测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的；为确保能从中选择出菌落数在30～300之间的平板进行计数。

2．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？提示：防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

1．分离分解尿素的细菌的实验设计原则(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。

(2)设立两种对照组：①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的选择培养基同时进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。

2．实验结果分析[特别提醒](1)稀释涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以3个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右的最好。

(2)在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组。

(3)在分析结果时，一定要考虑所设臵的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。

对应学生用书P20[例1]下表是培养分解尿素的细菌的培养基配方，请回答下面的问题：(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是________，提供氮源的是________。

(2)绝大多数微生物都能利用________，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解________。

(3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？[思路点拨][精讲精析]碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质，所以该培养基中碳源是葡萄糖，氮源是尿素。

该培养基的配方中含有凝固剂——琼脂，所以，配制的一定为固体培养基。

绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。

选择的原理是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。

[答案](1) 葡萄糖尿素(2)葡萄糖尿素(3)该培养基对微生物具有选择作用。

以尿素为唯一氮源的培养基可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。

(1)选择培养微生物的方法通常有两种：①可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使它成为一种加富培养基。

②可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。

(2)原则上只有目的微生物才能在选择培养基上生长。

但实际上，微生物培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需要的微生物，还需要进一步的验证。

分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧C．①③⑤⑧D．①④⑥⑦解析：选C要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。

[例2]一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。

下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：实验步骤：(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

(2)选用______________法接种样品。

(3)适宜温度下培养。

结果分析：(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是()A．一个平板，统计的菌落数是23B．两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25(2)一同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)____________。

(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为_____________。

(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？[精讲精析]实验步骤：(2)若要对大肠杆菌进行计数，常用稀释涂布平板法接种样品。

结果分析：(1)在选取样品时，应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。

(2)每毫升样品中菌株数＝平均菌落数稀释液体积×稀释倍数即23.4÷0.2×106＝1.17×108。