食品免疫学 免疫检测技术-1
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间接凝集反应(indirect agglutination): 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体
表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在 电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现 象
按原理，间接凝集反应可分为如下4种类型：
正向间接凝集试验 反向间接凝集试验 间接凝集抑制试验 协同凝集试验
➢正向间接凝集试反应 用抗原致敏载体--检测抗体
➢反向间接凝集反应
用抗体致敏载体----检测抗原
➢间接凝集抑制试验
用抗原致敏载体—竞争法检测抗原
➢协同凝集反应 SPA能与IgG的Fc片段非特异性结合,同时不 影响Fab片段的活性,所以当带有SPA的金黄色 葡萄球菌与抗体混合,再加入适量的相应抗原,产 生凝集现象。
实际应用的凝集反应 1.血凝试验(直接凝集）
1.火箭免疫电泳 2.对流免疫电泳 3.免疫电泳 4.免疫固定电泳
1.火箭免疫电泳
原理
电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向 正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的 基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉 淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复 合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原 量呈正相关。
免疫检测技术（1） 非标记免疫检测技术
第1节 凝集反应
凝集反应定义
细菌、螺旋体、红细胞或其他颗粒性抗原， 或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成 致敏颗粒后，与相应抗体（或抗原）发生特 异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼 可见的凝集现象。
凝集反应的阶段和特点
反应阶段： 抗原抗体的特异性结合阶段 出现肉眼可见凝集阶段
Coomb实验在临床的应用
在输血上的应用--血型抗原抗体的检查 对新生儿溶血性贫血性疾病的诊断 对溶血性贫血的研究 细菌或立克次体的不完全抗体检查
第2节 沉淀反应
沉淀反应（precipitation）是指可溶性 抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性 结合而出现的沉淀现象,其特性与经典的抗 原抗体反应相同。
(二)免疫浊度测定
原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适 时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的 抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现 代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含 量。
影响免疫浊度测定的因素
1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强、效价高、亲和力
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合阶段。形成肉眼可见免疫复合物
快速但不可见，免疫比浊 的阶段。沉淀线或沉淀环
法中的速率法就是利用此 的观察以及免疫比浊法中
阶段测定免疫复合物形成 的终点法就是测定此阶段
的速率。
形成的复合物
一、液体内沉淀试验
(一) 絮状沉淀试验
原理：絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混 合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合 形成肉眼可见的絮状沉淀物。 特点：方法受抗原抗体比例的影响非常明显 应用：测定抗原抗体反应的最适比例，可分 为三种类型。
• 可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，
一般为1:64，同时设不含标本的稀释液对照孔。
2.胶乳凝集试验（间接凝集）
三、 抗球蛋白试验 （检测抗体的凝集反应）
抗球蛋白试验 又称
Coombs试验
（一）直接Coombs试验
检测红细胞上抗体
不完全抗体
（二）间接Coombs试验
检测血清中的抗红细胞抗体
反应特点： IgM的作用比IgG大数百倍,易出现可见凝集 IgG与抗原结合后，常不出现凝集反应，称不 完全抗体。
一、直接凝集反应
直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质
的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。
Q
（一）玻片凝集-检测血型
A
B
无反应
凝集
强的多抗；多用R型抗体 3.抗原抗体反应的溶液：PH为6.5～8.5 ，PBS 4.增浊剂：吐温-20，PEG等
免疫浊度测定分类：
透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 免疫胶乳比浊法
二、凝胶内沉淀试验
原理
原理：可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形 成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当 的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
单向免疫扩散＋电泳 （定量检测技术）
+
-
火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本
2.对流免疫电泳
蛋白质抗原常 带较强的负电
－ 荷，在电场中
向正极移动
通电
抗体球蛋白 带负电荷较少，
籍电渗作用向 ＋
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
（二）双向扩散试验 （平板法） 二、双向扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀 的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径 Biblioteka Baidu3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。
常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰 胺凝胶。
（一）单向扩散试验 （平板法）
定量试验
原理：抗体与待测的抗原,在 两者比例合适的部位结合 形成沉淀环。环的大小与 抗原的浓度成正相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
主要应用
➢1.抗原或抗体的存在, 及相对含量的估计
➢2.抗原或抗体相对分子 量的估计
➢3.抗原性质的分析 ➢4.抗原或抗体纯度的鉴定
➢5.抗体效价的滴定
三、免疫电泳技术
电泳与电渗 电泳
-
+
电渗
免疫电泳技术
电泳分析 ＋
+
沉淀反应
-
火箭免疫电泳 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本
主要的技术类型
红细胞（抗凝血） 反应体系 （载玻片）
抗血清（血型抗体）
（二）试管凝集-肥达反应
反应体系 （试管）
菌液 血清
方法评价：
半定量试验 简便、快速 敏感度低 可有假阳性
临床应用：
Widal reaction Weil-felix reaction Wright test:布鲁菌病 交叉配血试验
（三） 间接凝集反应
表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在 电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现 象
按原理，间接凝集反应可分为如下4种类型：
正向间接凝集试验 反向间接凝集试验 间接凝集抑制试验 协同凝集试验
➢正向间接凝集试反应 用抗原致敏载体--检测抗体
➢反向间接凝集反应
用抗体致敏载体----检测抗原
➢间接凝集抑制试验
用抗原致敏载体—竞争法检测抗原
➢协同凝集反应 SPA能与IgG的Fc片段非特异性结合,同时不 影响Fab片段的活性,所以当带有SPA的金黄色 葡萄球菌与抗体混合,再加入适量的相应抗原,产 生凝集现象。
实际应用的凝集反应 1.血凝试验(直接凝集）
1.火箭免疫电泳 2.对流免疫电泳 3.免疫电泳 4.免疫固定电泳
1.火箭免疫电泳
原理
电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向 正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的 基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉 淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复 合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原 量呈正相关。
免疫检测技术（1） 非标记免疫检测技术
第1节 凝集反应
凝集反应定义
细菌、螺旋体、红细胞或其他颗粒性抗原， 或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成 致敏颗粒后，与相应抗体（或抗原）发生特 异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼 可见的凝集现象。
凝集反应的阶段和特点
反应阶段： 抗原抗体的特异性结合阶段 出现肉眼可见凝集阶段
Coomb实验在临床的应用
在输血上的应用--血型抗原抗体的检查 对新生儿溶血性贫血性疾病的诊断 对溶血性贫血的研究 细菌或立克次体的不完全抗体检查
第2节 沉淀反应
沉淀反应（precipitation）是指可溶性 抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性 结合而出现的沉淀现象,其特性与经典的抗 原抗体反应相同。
(二)免疫浊度测定
原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适 时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的 抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现 代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含 量。
影响免疫浊度测定的因素
1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强、效价高、亲和力
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合阶段。形成肉眼可见免疫复合物
快速但不可见，免疫比浊 的阶段。沉淀线或沉淀环
法中的速率法就是利用此 的观察以及免疫比浊法中
阶段测定免疫复合物形成 的终点法就是测定此阶段
的速率。
形成的复合物
一、液体内沉淀试验
(一) 絮状沉淀试验
原理：絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混 合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合 形成肉眼可见的絮状沉淀物。 特点：方法受抗原抗体比例的影响非常明显 应用：测定抗原抗体反应的最适比例，可分 为三种类型。
• 可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，
一般为1:64，同时设不含标本的稀释液对照孔。
2.胶乳凝集试验（间接凝集）
三、 抗球蛋白试验 （检测抗体的凝集反应）
抗球蛋白试验 又称
Coombs试验
（一）直接Coombs试验
检测红细胞上抗体
不完全抗体
（二）间接Coombs试验
检测血清中的抗红细胞抗体
反应特点： IgM的作用比IgG大数百倍,易出现可见凝集 IgG与抗原结合后，常不出现凝集反应，称不 完全抗体。
一、直接凝集反应
直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质
的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。
Q
（一）玻片凝集-检测血型
A
B
无反应
凝集
强的多抗；多用R型抗体 3.抗原抗体反应的溶液：PH为6.5～8.5 ，PBS 4.增浊剂：吐温-20，PEG等
免疫浊度测定分类：
透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 免疫胶乳比浊法
二、凝胶内沉淀试验
原理
原理：可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形 成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当 的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
单向免疫扩散＋电泳 （定量检测技术）
+
-
火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本
2.对流免疫电泳
蛋白质抗原常 带较强的负电
－ 荷，在电场中
向正极移动
通电
抗体球蛋白 带负电荷较少，
籍电渗作用向 ＋
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
（二）双向扩散试验 （平板法） 二、双向扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀 的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径 Biblioteka Baidu3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。
常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰 胺凝胶。
（一）单向扩散试验 （平板法）
定量试验
原理：抗体与待测的抗原,在 两者比例合适的部位结合 形成沉淀环。环的大小与 抗原的浓度成正相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
主要应用
➢1.抗原或抗体的存在, 及相对含量的估计
➢2.抗原或抗体相对分子 量的估计
➢3.抗原性质的分析 ➢4.抗原或抗体纯度的鉴定
➢5.抗体效价的滴定
三、免疫电泳技术
电泳与电渗 电泳
-
+
电渗
免疫电泳技术
电泳分析 ＋
+
沉淀反应
-
火箭免疫电泳 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本
主要的技术类型
红细胞（抗凝血） 反应体系 （载玻片）
抗血清（血型抗体）
（二）试管凝集-肥达反应
反应体系 （试管）
菌液 血清
方法评价：
半定量试验 简便、快速 敏感度低 可有假阳性
临床应用：
Widal reaction Weil-felix reaction Wright test:布鲁菌病 交叉配血试验
（三） 间接凝集反应