半乳糖醛酸标准品

半乳糖醛酸标准品（分析纯），果胶标准品.
果胶酶活力的测定
果胶酶活力单位1 g或1 mL酶液在50℃、pH 5.0的条件下,1 h分解果胶产生1 mg半乳糖醛酸为一个酶活单位。

半乳糖醛酸标准曲线制作精确称取1.000 g半乳糖醛酸,用缓冲溶液定容至1 000 mL,获得1 mg/mL的半乳糖醛酸溶液。

取9支25 mL的刻度试管编号,并按表1加入各种试剂。

制备酶液:吸取1 mL浓缩酶液于一定体积的容量瓶中,用缓冲溶液定容。

加入试剂后在混合振荡器上振荡均匀,在沸水浴中加热5 min,取出后立即用流水冷却,加蒸馏水定容至25 mL(以1号试管作为空白调零),在540 nm波长下比色测定吸光度。

以吸光度纵坐标,半乳糖醛酸含量为横坐标,绘制标准曲线。

酶活力测定步骤①于甲、乙两支25 mL比色管中分别加入果胶底物5 mL,在50℃水浴中预热5 min;②于甲、乙管中分别加4 mL磷酸-柠檬酸缓冲液,甲管中加入1 mL稀释酶液,立即摇匀,在50℃水浴中准确反应30 min,立即给乙管中加1 mL稀释酶液,立即放入沸水浴中煮沸5min,终止反应,冷却;③分别取甲、乙管中反应液2 mL于两支25 mL比色管中,再分别给甲、乙管加2 mL蒸馏水,5 mLDNS试剂,混合,沸水浴煮沸5 min,取出,立即冷却。

加蒸馏水定容到25mL。

3 600 r/min离心8 min,取上清液,以标准空白为基准调零,在540 nm处测吸光度(吸光度要在0.025~0.843之间,否则重新稀释)。

酶活力计算:X=[(A甲-A乙)×Dr×5]/(K×t)式中,A甲为酶样吸光度;A乙为酶空白样的吸光度;K为标准曲线斜率;5为测定酶活时取了反应液的1/5;Dr为稀释倍数;t为反应时间(h)。

. 壳聚糖固定化酶的制备
准确称取壳聚糖1.0g 溶于2%的醋酸中磁力搅拌.均匀后逐滴滴加0.25mol/L NaOH 溶液至pH 值7.0 加入5%戊二醛并磁力搅拌10h 静置1h 4 800r/min 离心15min 用蒸馏水清洗直到中性为止将戊二醛交联后的壳聚糖加入到果胶酶液中缓慢震荡反应30min 后于4 下固定12h 以上并用蒸馏水将未固定的果胶酶清洗干净最终得到壳聚糖固定化果胶酶产品
相对酶活力：以酶活力最大值为100%，其余数值与其对比，即相对酶活力，以质量分数表示。

固定化酶活力回收率=（固定化酶总活力/ 加入游离酶总活力）×100%。

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固定化酶活测定方法
羧甲基纤维素（CMC）法.
：称取4.0g固定化酶，加入用缓冲液配制的1.0%CMC，在50 的恒温振荡器中保温30min，加入5mL DNS溶液沸水浴反应5min，冷却后加入15mL去离子水，于波长550nm处测定其吸光度值酶活计算和酶活回收率：通过标准曲线将吸光度值换算为生成的葡萄糖量，根据下列公式计算固定化酶活以及酶活回收率固定化酶活计算公式：
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取适量纤维素酶液，加到3 mL 质量分数为3．5%的海藻酸钠溶液中，混合均匀，再加入适量戊二醛溶液，在摇床中恒温振荡，用5 mL 注射器吸取混合液，以10 cm 左右高度逐滴注入质量分数为2%的CaCl2 溶液中，立即形成光滑的凝胶状小球，滤出凝胶小球，更换CaCl2 溶液，置于 4 ℃冰箱中静置硬化2 h 再次滤出凝胶小球，用质量分数为0．9% 的NaCl溶液洗涤3 次，再用蒸馏水冲洗2 次，得固定化纤维素酶用吸水纸吸干小球表面水分，称重，贮存于4 ℃冰箱中备用.
混合固定化
壳聚糖微球的制备
称取壳聚糖2 g，溶于100 mL 1 %乙酸溶液中，经磁力搅拌器充分搅拌，溶解后静置到气泡消失。

将上述溶液用5 mL 的注射器逐滴加入到250 mL混合液(10 % NaOH与95 %乙醇，体积比为4∶1)中，得到粒度均匀、富有弹性的壳聚糖微球，抽滤，蒸馏水洗涤至中性，用吸水纸吸干表面水分，收集微球，在4℃冰箱中过夜，使微球硬化[6]
酶的固定化方法
取壳聚糖微球0.40 g放入100 mL具塞锥形瓶中，加入一定浓度的戊二醛2 mL，加入纤维素酶和果胶酶的酶液、柠檬酸钠缓冲液6 mL，50 ℃，摇床振荡固定化。

1.2.3 纤维素酶与果胶酶活力测定方法
分别采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定固定化酶中纤维素酶和果胶酶的酶活.
葡萄糖标液（1mg/ml）：准确称取0.1g葡萄糖，用水定容至100ml。

DNS试剂：酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。

否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。

且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50℃。

储于棕色瓶中放置7-10 d后使用。

有效期为6个月。

葡萄糖标准曲线的测定（DNS法）
取9支25ml比色管，按表1加入相关溶液后置于沸水浴中反应5min后取出，用冷水冷却约10min至室温，用水定容至25ml(充分混匀)。

在紫外分光光度计上用1cm比色杯，在540nm 波长处，以0号管为空白，记录吸光度，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

表.1 葡萄糖标准曲线测定相关溶液加量表
管号葡萄糖标液（ml) 蒸馏水
（ml）
DNS溶液(ml)
比色管葡萄糖含量
(mg）
0 0.00 2.00 1.50 0.00
1 0.20 1.80 1.50 0.20
2 0.40 1.60 1.50 0.40
3 0.60 1.40 1.50 0.60
4 0.80 1.20 1.50 0.80
5 1.00 1.00 1.50 1.00
6 1.20 0.80 1.50 1.20
7 1.40 0.60 1.50 1.40
8 1.60 0.40 1.50 1.60
6、研究的具体步骤和方法
6.1材料与方法
6.1.1试剂与材料
纤维素酶，BR；果胶酶，BR；甲基纤维素钠，CR,壳聚糖；果胶，半乳糖醛酸(干基计) ;可见分光光度计;电子天平;双功能水浴振荡器等。

6.1.2 方法
6.1.2．1壳聚糖微球的制备
称取壳聚糖2 g，溶于loo mL I％乙酸溶液中，经磁力搅拌器充分搅拌，溶解后静置到气泡消失。

将上述溶液用5 mL的注射器逐滴加入到250 mL混合液(10％Na0H与95％乙醇，体积比为4：1)中，得到粒度均匀、富有弹性的壳聚糖微球，抽滤，蒸馏水洗涤至中性，用吸水纸吸干表面水分，收集微球，在4℃冰箱中过夜，使微球硬化。

6.1．2．2酶的固定化方法
分别取5份壳聚糖微球0.40 g放入100 mL具塞锥形瓶中，加入一定浓度的戊二醛2 mL，加入纤维素酶和果胶酶的酶液、柠檬酸钠缓冲液6 mL，50℃，摇床振荡固定化。

6.1．2．3纤维素酶与果胶酶活力测定方法
分别采用3，5．二硝基水杨酸比色法测定固定化酶中纤维素酶和果胶酶的酶活
6.2.1单因素实验
6.2.1.1戊二醛浓度对固定化酶活力的影响
取5份壳聚糖微球放入锥形瓶中，分别加入不同浓度的戊二醛(2％、4％、6％、8％、10％)2mL，果胶酶3mL(5mg/mL)和纤维素酶l mL(5 mg/mL)，pH 4．5的柠檬酸钠缓冲液6 mL，50℃，摇床振荡l h，进行固定化。

2.1.2加酶量对固定化酶活力的影响
取5份壳聚糖微球放入锥形瓶中，分别加入浓度为6％的戊二醛2mL，总量为4、8、12、16、20、24mL 的酶液Ⅳ艰腔醇：V纤维确=3：1)，即总加酶量分别加入20、40、60、100、120 mg，pH4．5的柠檬酸钠缓冲液6mL，50℃，摇床振荡l h，进行固定化。

6.2.1．3固定化时间对固定化酶活力的影响
取5份壳聚糖微球放入锥形瓶中，加入浓度为6％的戊二醛2mL，果胶酶6％和纤维素酶2 mL，pH4．5的柠檬酸钠缓冲液6mL，50℃，分别在摇床振荡l、2、3、4、5 h，进行固定化。

6.2.1.4 pH对固定化酶活力的影响
取5份壳聚糖微球放入锥形瓶中，加入浓度为6％的戊二醛2mL，果胶酶6InL和纤维素酶2mL，再分别加入pH为3．5、4．O、4．5、5．O、5．5的柠檬酸钠缓冲液6ml，50℃，摇床振荡2 h，进行固定化。

2．2果胶酶和纤维素酶共固定的最佳工艺
6.2．2．1正交试验
在单因素试验基础上，针对戊二醛浓度、加酶量、固定化时间、pH 4个因素，进行四因素3水平的L9正
交试验设计，以确定固定化最优条件。