肝炎的分子诊断与临床应用ppt课件
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34
肝炎分子诊断综合检查申请单
姓名 必填 门诊号
性别（必填） □男 / □女
科别
住院号
年龄 必填 病房
床号
送检医院
送检医生 必填
医生联系电话 必填
采集时间（必填） 年 月 日 时 送检时间（必填） 年 月 日 时
临床印象： □ 乙肝 □ 丙肝 □ 混合性肝炎 □ 肝硬化 □ 肝癌 现病史（临床表现以及病程）
准确判断治疗起点/终点
线性范围 乙肝：20-1.7×108 IU/mL
每批试剂均使用 WHO标准品校准
每个样本使用同 源性内标定量
极佳的重复性，结果可靠 正确指导抗病毒治疗
保证定量结果的准确性 和可溯源性
避免结果不准确
采用AmpErase酶
减少交叉污染
目前在国内唯一满足治疗指南和专家共识的HBV DNA和 HCV RNA检测试剂
+ 专门检测LAM变异位点：180，181，204，173 + 专门检测ADV变异位点：181，233，236
30
艾迪康医学检验中心P区基因变异检验报告单样张
31
传播途径:主要血液/体液传播(似HBV) 是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因 无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见 感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上 免疫力不牢固
11
HBeAg消失
HBeAg 血清学转换
ALT正常
治疗终点
HBsAg 清除及血清学转换
组织学改善
cccDNA 清除
HBV DNA 降低/消失
*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9
10
开始治疗--- 基于 HBV DNA、 ALT水平和疾病发展阶段
治疗第12周评估是否存在原发性无应答 (较基线下降<1 log)
治疗第24周评估
完全病毒学应答
<60 IU/mL
继续治疗 每6个月监测HBV DNA
部分病毒学应答
60 – 2,000 IU/mL
加其他药物治疗 每3个月监测HBV DNA
检测项目（注意：请在要检测的项目前打“√”确认 ） ★ 核苷类似药药物敏感性
第第 一二 联联
检送 验检 中医 心院 联联
□ HBV P 区耐药检测
□ 拉米夫定耐药检测
□ 阿德福韦酯耐药检测
★ e 抗原阴性
□ HBV 前 C 区和 C 区变异检测
□ HBV 前 C 区 1896 位点检测(荧光定量 PCR 法)
7
+ 定量PCR技术检测患者的血清HBVDNA含量，能更准确地反映病毒复制程度， 对HBV相关疾病的诊断、治疗、判断预后意义重大。
+ QF-PCR是国内常用的定量检测血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系统是美 国食品药品监督管理局(FDA)批准用于血清HBVDNA定量检测的方法。它具 有灵敏度高，线性范围广，实时监控，重复性好，可检测A、B、C、D、E、 F、G、前C区变异等多基因型DNA载量优点。
13
根据HBV全基因核苷酸序列的差异，分为不同 基因型:A.B.C.D.E.F.G.H共8个型
不同的基因型具有不同地域分布 我国主要是B\C型为主，偶有A型 北方－C型
特征
感染性 HbeAg阳性率 HbeAg自然清除时间 HBV DNA载量
致病性 HCC发生率 干扰素治疗完全应答率 抗病毒治疗效果 肝癌手术治疗预后 癌栓栓塞治疗效果
目前全国慢性乙肝病人2000万人，每年死于与乙 肝相关的肝病患者达28万例，发病率和死亡率都位居 前三位。每年造成的直接经济损失约达3600亿元人民 币。
4
在临床上应用核酸（DNA/RNA) 和分子生物 学技术, 在基因水平诊断和监控疾病情况 和疗效，评估疾病的检测方法。
5
HBV 分子诊断的 临床应用
Liaw et al. 1999. Hepatology 30: 567
22
23
80 71
70
65
60
55
50
46
40 30 23 20 10
0 拉米夫定
29
18 11 03
111
阿德福韦(eAg-)
恩替卡韦
21.6 4.4
8.6 2.7
替比夫定(eAg+) 替比夫定(eAg-)
1年 2年 3年 4年 5年
A181T/V N236T L180M + M204V/I ± I169T ± V173L ± M250V L180M + M204V/I ±T184G ±S202I/G
拉米夫定 S R R I S R
R
界于中间
替比夫定
恩替卡韦
S
S
R
I
R
I
S
S
S
S
R
R
R
R
阿德福韦 S S S R R S
耐药
替诺福韦 S S S S I S
19
原发无应答
病毒学（部分） 应答
临床耐药
20
21
耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低 耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处
病毒反弹, 血清转氨酶升高, HBeAg血清转换率降低 肝脏病理进展 肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡 肝移植后肝炎复发率增高 公共卫生危害 耐药病毒株的传播 免疫逃逸
□ HBV 前 S 区和 S 区变异检测
□ HCV 基因分型(测序法：6 个基因型及其亚型)
□ HCV 基因分型(荧光 PCR 法：1a、1b、2a、2b、2c、3a)
□ 其他肝炎病毒核酸检测(荧光定量 PCR 法)
标本类型（必填） □ 血清
□ EDTA 抗凝血浆（紫头管）
□ 粪便（HAV、HEV 核酸检测）
8
检测灵敏度 线性范围 检测基因型 检测样本量
Sample Type SFDA注册证
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test, v2.0 20 IU/mL 20 – 1.7 x 108 IU/mL A-H 650 mL 血清或EDTA抗凝血浆
Q3
9
高灵敏度 乙肝：20 IU/mL
基因型
B型
C型
低 低 短 低 轻 低（低年龄组高） 高 高 好 好
高 高 长 高 重 高（高年龄组高） 低 低 差 差
+ 乙肝病毒:高变异性 1/105 + 24h 一万亿-十万亿拷贝*变异：一千万—一亿 + 复制过程:DNA-RNA-DNA + HBV逆转录酶:缺乏严格的校正机制 + 变异:自然变异,免疫压力等等
• 黄病毒科 丙型肝炎病毒属 • 球形有包膜的RNA病毒，直径50nm • 病毒基因为单股正链RNA，链全 长约10Kb
32
HCV RNA 检测
• 确定引起病毒性肝炎的直接 原因
• 通过病毒数量变化来监测治 疗效果
33
HCV基因分型
实时荧光PCR法： 检测三个基因型（1型、2型、3型） PCR产物直接测序法： 1-6型及亚型 1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a ,6b,6k
高灵敏度 HBV DNA定量
HBV 感染监测 药物疗效检测 感染早期检测
HBV 基因分型
病情预后发展 检测 抗病毒药物效 果预测
P区耐药检测
抗药性监测 治疗药物选择
C区启动子变异
确定病毒变异
S 区变异
确定隐觅性病毒
类型
变异
判断治疗效果
判断疫苗效果 判断肝炎预后
确定治疗方案
+ 高精度病毒载量检测系统 （ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）
16
乙肝病毒P区耐药
原本有效的药物 对发生耐药变异后的病毒束手无策
变异前，药物有效抑制病毒
变异后，药物对病毒束手无策
17
18
+ 长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引 起耐药的基因突变位点主要集中于P区
+ 原因：抗病毒药物作来自在病毒P区药物靶点上， 引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作用 下降，进而产生耐药。
肝炎分子诊断项目开展介绍
1
1、了解肝炎分子诊断 2、分子诊断在HBV中的临床应用 3、分子诊断在HCV中的临床应用 4、ADICON已开展的肝炎分子诊断项目
2
我国乙肝病毒感染率概况
3
我国乙肝病毒感染率概况
《2006－2010年全国乙型病毒性肝炎防治规划》 显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国 家，全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人 长期携带乙肝病毒。
Bar Code 条形码粘贴
处
病程，病史 目前用药情况，服
药时间
专 用 申 请 单
35
谢谢！
36
S
S
27
1.一种药物产生耐药时，需要用具有不同耐药 位点药物代替
2.为减少耐药情况，建议从治疗开始就使用 具有两种不同耐药位点药物一起治疗
3.由于抗病毒药物的耐药以及治疗的长期性， 在治疗过程中应该定期检查，或是在发现 药物治疗效果不佳时需排除产生耐 药的可 能
28
检测
检测
检测
检测
29
+ 目前检测的变异位点： P区耐药位点11个 （169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250）
□ HBVC 区 1762/1764 位点检测(荧光定量 PCR 法)
★ 预后及动态监测
□ 高灵敏度 HBV-DNA（罗氏 COBAS：最低检测下限 12 IU，EDTA 抗凝血浆 2ml，适用于常规乙肝定量阴性的患者）
□ HBV 基因分型(测序法：8 个基因型)
□ HBV 基因分型(荧光 PCR 法：2 个基因型)
拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦为基因型耐药发生率, 替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率
24
+ 长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药 的基因突变位点主要集中于P区
+ 耐药基因分析在临床药物选择上的应用 目前最常见P区耐药位点11个 （169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250）
+ 由于本QF-PCR试剂盒的线性范围为1.0x 103 copies／mL～1.0x 108 copies／mL， 对于低于1.0 x 103 copies／mL标本的检测结果不能给出具体拷贝值，有存在漏 检的可能。 而COBAS 系统线性范围为20-1.7×108 IU/mL，因此， COBAS 系 统更能准确反映血清HBV DNA含量。
*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897.
不充分病毒学应答
>2,000 IU/mL
改用或加用更强药物 每6个月监测HBV DNA
抗病毒治疗应将HBV DNA降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量 PCR方 法（灵敏度10-15 IU/mL）的最低检出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242
备注
1、采集血清(浆)量 2ml，抗凝血标本请将血浆分离后送检，粪便请使用专用粪便采集器送检具体详见传染病项目
标本取材及物流注意事项；
2、对于收集后当天进行检测的血清（浆）样本，可在 4oC 条件下保存运送，如需长期保存请保持-30oC 以下条件
冰冻保存；粪便样本请在 4oC 条件下 48 小时内送达实验室。 3、为了能及时并准确检查及诊断，请详细填写本申请表；
12
+ 2009年EASL指南提出的治疗终点： + 最理想的治疗终点：持续的HBsAg 消失，伴或不
伴抗HBs 抗体出现。 + 满意的治疗终点：在HBe Ag 阳性患者中，出现
持续的HBeAg 血清转换 + 次级的满意治疗终点：尽可能降低病毒DNA水平
（降至实时定量 PCR检测限以下：10-15IU/ml）
□ 肝纤维化
抗病毒药物使用情况： □ 拉米夫定(贺普丁)____ 年 月至____ 年 月 □ 恩替卡韦____ 年 月至____ 年 月 □ 替诺福韦____年 月至____ 年 月 □ 恩曲他滨____年 月至____ 年 月
□ 阿德福韦(贺维力)____ 年 月至____ 年 月 □ 替比夫定____ 年 月至____ 年 月 □ 干扰素____ 年 月至____ 年 月
25
常用抗病毒药物的耐药位点
拉米夫定 恩曲他滨 阿德福韦 恩替卡韦 特比夫定
M204I/V L180M V173L V173L L180M M204I/V A181V N236T T184A（G/I/S) M250V M204I/V
26
常见变异的交叉耐药性
敏感
野生型
M204I L180M + M204V
肝炎分子诊断综合检查申请单
姓名 必填 门诊号
性别（必填） □男 / □女
科别
住院号
年龄 必填 病房
床号
送检医院
送检医生 必填
医生联系电话 必填
采集时间（必填） 年 月 日 时 送检时间（必填） 年 月 日 时
临床印象： □ 乙肝 □ 丙肝 □ 混合性肝炎 □ 肝硬化 □ 肝癌 现病史（临床表现以及病程）
准确判断治疗起点/终点
线性范围 乙肝：20-1.7×108 IU/mL
每批试剂均使用 WHO标准品校准
每个样本使用同 源性内标定量
极佳的重复性，结果可靠 正确指导抗病毒治疗
保证定量结果的准确性 和可溯源性
避免结果不准确
采用AmpErase酶
减少交叉污染
目前在国内唯一满足治疗指南和专家共识的HBV DNA和 HCV RNA检测试剂
+ 专门检测LAM变异位点：180，181，204，173 + 专门检测ADV变异位点：181，233，236
30
艾迪康医学检验中心P区基因变异检验报告单样张
31
传播途径:主要血液/体液传播(似HBV) 是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因 无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见 感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上 免疫力不牢固
11
HBeAg消失
HBeAg 血清学转换
ALT正常
治疗终点
HBsAg 清除及血清学转换
组织学改善
cccDNA 清除
HBV DNA 降低/消失
*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9
10
开始治疗--- 基于 HBV DNA、 ALT水平和疾病发展阶段
治疗第12周评估是否存在原发性无应答 (较基线下降<1 log)
治疗第24周评估
完全病毒学应答
<60 IU/mL
继续治疗 每6个月监测HBV DNA
部分病毒学应答
60 – 2,000 IU/mL
加其他药物治疗 每3个月监测HBV DNA
检测项目（注意：请在要检测的项目前打“√”确认 ） ★ 核苷类似药药物敏感性
第第 一二 联联
检送 验检 中医 心院 联联
□ HBV P 区耐药检测
□ 拉米夫定耐药检测
□ 阿德福韦酯耐药检测
★ e 抗原阴性
□ HBV 前 C 区和 C 区变异检测
□ HBV 前 C 区 1896 位点检测(荧光定量 PCR 法)
7
+ 定量PCR技术检测患者的血清HBVDNA含量，能更准确地反映病毒复制程度， 对HBV相关疾病的诊断、治疗、判断预后意义重大。
+ QF-PCR是国内常用的定量检测血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系统是美 国食品药品监督管理局(FDA)批准用于血清HBVDNA定量检测的方法。它具 有灵敏度高，线性范围广，实时监控，重复性好，可检测A、B、C、D、E、 F、G、前C区变异等多基因型DNA载量优点。
13
根据HBV全基因核苷酸序列的差异，分为不同 基因型:A.B.C.D.E.F.G.H共8个型
不同的基因型具有不同地域分布 我国主要是B\C型为主，偶有A型 北方－C型
特征
感染性 HbeAg阳性率 HbeAg自然清除时间 HBV DNA载量
致病性 HCC发生率 干扰素治疗完全应答率 抗病毒治疗效果 肝癌手术治疗预后 癌栓栓塞治疗效果
目前全国慢性乙肝病人2000万人，每年死于与乙 肝相关的肝病患者达28万例，发病率和死亡率都位居 前三位。每年造成的直接经济损失约达3600亿元人民 币。
4
在临床上应用核酸（DNA/RNA) 和分子生物 学技术, 在基因水平诊断和监控疾病情况 和疗效，评估疾病的检测方法。
5
HBV 分子诊断的 临床应用
Liaw et al. 1999. Hepatology 30: 567
22
23
80 71
70
65
60
55
50
46
40 30 23 20 10
0 拉米夫定
29
18 11 03
111
阿德福韦(eAg-)
恩替卡韦
21.6 4.4
8.6 2.7
替比夫定(eAg+) 替比夫定(eAg-)
1年 2年 3年 4年 5年
A181T/V N236T L180M + M204V/I ± I169T ± V173L ± M250V L180M + M204V/I ±T184G ±S202I/G
拉米夫定 S R R I S R
R
界于中间
替比夫定
恩替卡韦
S
S
R
I
R
I
S
S
S
S
R
R
R
R
阿德福韦 S S S R R S
耐药
替诺福韦 S S S S I S
19
原发无应答
病毒学（部分） 应答
临床耐药
20
21
耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低 耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处
病毒反弹, 血清转氨酶升高, HBeAg血清转换率降低 肝脏病理进展 肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡 肝移植后肝炎复发率增高 公共卫生危害 耐药病毒株的传播 免疫逃逸
□ HBV 前 S 区和 S 区变异检测
□ HCV 基因分型(测序法：6 个基因型及其亚型)
□ HCV 基因分型(荧光 PCR 法：1a、1b、2a、2b、2c、3a)
□ 其他肝炎病毒核酸检测(荧光定量 PCR 法)
标本类型（必填） □ 血清
□ EDTA 抗凝血浆（紫头管）
□ 粪便（HAV、HEV 核酸检测）
8
检测灵敏度 线性范围 检测基因型 检测样本量
Sample Type SFDA注册证
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test, v2.0 20 IU/mL 20 – 1.7 x 108 IU/mL A-H 650 mL 血清或EDTA抗凝血浆
Q3
9
高灵敏度 乙肝：20 IU/mL
基因型
B型
C型
低 低 短 低 轻 低（低年龄组高） 高 高 好 好
高 高 长 高 重 高（高年龄组高） 低 低 差 差
+ 乙肝病毒:高变异性 1/105 + 24h 一万亿-十万亿拷贝*变异：一千万—一亿 + 复制过程:DNA-RNA-DNA + HBV逆转录酶:缺乏严格的校正机制 + 变异:自然变异,免疫压力等等
• 黄病毒科 丙型肝炎病毒属 • 球形有包膜的RNA病毒，直径50nm • 病毒基因为单股正链RNA，链全 长约10Kb
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HCV RNA 检测
• 确定引起病毒性肝炎的直接 原因
• 通过病毒数量变化来监测治 疗效果
33
HCV基因分型
实时荧光PCR法： 检测三个基因型（1型、2型、3型） PCR产物直接测序法： 1-6型及亚型 1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a ,6b,6k
高灵敏度 HBV DNA定量
HBV 感染监测 药物疗效检测 感染早期检测
HBV 基因分型
病情预后发展 检测 抗病毒药物效 果预测
P区耐药检测
抗药性监测 治疗药物选择
C区启动子变异
确定病毒变异
S 区变异
确定隐觅性病毒
类型
变异
判断治疗效果
判断疫苗效果 判断肝炎预后
确定治疗方案
+ 高精度病毒载量检测系统 （ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）
16
乙肝病毒P区耐药
原本有效的药物 对发生耐药变异后的病毒束手无策
变异前，药物有效抑制病毒
变异后，药物对病毒束手无策
17
18
+ 长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引 起耐药的基因突变位点主要集中于P区
+ 原因：抗病毒药物作来自在病毒P区药物靶点上， 引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作用 下降，进而产生耐药。
肝炎分子诊断项目开展介绍
1
1、了解肝炎分子诊断 2、分子诊断在HBV中的临床应用 3、分子诊断在HCV中的临床应用 4、ADICON已开展的肝炎分子诊断项目
2
我国乙肝病毒感染率概况
3
我国乙肝病毒感染率概况
《2006－2010年全国乙型病毒性肝炎防治规划》 显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国 家，全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人 长期携带乙肝病毒。
Bar Code 条形码粘贴
处
病程，病史 目前用药情况，服
药时间
专 用 申 请 单
35
谢谢！
36
S
S
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1.一种药物产生耐药时，需要用具有不同耐药 位点药物代替
2.为减少耐药情况，建议从治疗开始就使用 具有两种不同耐药位点药物一起治疗
3.由于抗病毒药物的耐药以及治疗的长期性， 在治疗过程中应该定期检查，或是在发现 药物治疗效果不佳时需排除产生耐 药的可 能
28
检测
检测
检测
检测
29
+ 目前检测的变异位点： P区耐药位点11个 （169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250）
□ HBVC 区 1762/1764 位点检测(荧光定量 PCR 法)
★ 预后及动态监测
□ 高灵敏度 HBV-DNA（罗氏 COBAS：最低检测下限 12 IU，EDTA 抗凝血浆 2ml，适用于常规乙肝定量阴性的患者）
□ HBV 基因分型(测序法：8 个基因型)
□ HBV 基因分型(荧光 PCR 法：2 个基因型)
拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦为基因型耐药发生率, 替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率
24
+ 长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药 的基因突变位点主要集中于P区
+ 耐药基因分析在临床药物选择上的应用 目前最常见P区耐药位点11个 （169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250）
+ 由于本QF-PCR试剂盒的线性范围为1.0x 103 copies／mL～1.0x 108 copies／mL， 对于低于1.0 x 103 copies／mL标本的检测结果不能给出具体拷贝值，有存在漏 检的可能。 而COBAS 系统线性范围为20-1.7×108 IU/mL，因此， COBAS 系 统更能准确反映血清HBV DNA含量。
*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897.
不充分病毒学应答
>2,000 IU/mL
改用或加用更强药物 每6个月监测HBV DNA
抗病毒治疗应将HBV DNA降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量 PCR方 法（灵敏度10-15 IU/mL）的最低检出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242
备注
1、采集血清(浆)量 2ml，抗凝血标本请将血浆分离后送检，粪便请使用专用粪便采集器送检具体详见传染病项目
标本取材及物流注意事项；
2、对于收集后当天进行检测的血清（浆）样本，可在 4oC 条件下保存运送，如需长期保存请保持-30oC 以下条件
冰冻保存；粪便样本请在 4oC 条件下 48 小时内送达实验室。 3、为了能及时并准确检查及诊断，请详细填写本申请表；
12
+ 2009年EASL指南提出的治疗终点： + 最理想的治疗终点：持续的HBsAg 消失，伴或不
伴抗HBs 抗体出现。 + 满意的治疗终点：在HBe Ag 阳性患者中，出现
持续的HBeAg 血清转换 + 次级的满意治疗终点：尽可能降低病毒DNA水平
（降至实时定量 PCR检测限以下：10-15IU/ml）
□ 肝纤维化
抗病毒药物使用情况： □ 拉米夫定(贺普丁)____ 年 月至____ 年 月 □ 恩替卡韦____ 年 月至____ 年 月 □ 替诺福韦____年 月至____ 年 月 □ 恩曲他滨____年 月至____ 年 月
□ 阿德福韦(贺维力)____ 年 月至____ 年 月 □ 替比夫定____ 年 月至____ 年 月 □ 干扰素____ 年 月至____ 年 月
25
常用抗病毒药物的耐药位点
拉米夫定 恩曲他滨 阿德福韦 恩替卡韦 特比夫定
M204I/V L180M V173L V173L L180M M204I/V A181V N236T T184A（G/I/S) M250V M204I/V
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常见变异的交叉耐药性
敏感
野生型
M204I L180M + M204V