流式细胞术在血小板检测中的应用于方法介绍

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注意事项 1. 采血时请用大号针管，抽出的前 2ml 血应弃去不用。 2. 尽量避免标本受到物理振动。 3. 取血后 10 分钟内完成染色操作。 4. 在 Falcon 管中加血标本 5l， 管壁上不能有残留血， 未染色的部分会影响试验结果。 5. 为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控 制。
3.
荧光抗体染色： (1) Falcon 管编号。 (2) 在对照管中加入 PE 同型对照、CD61 PerCP、PAC-1 各 20l，RGDS 加
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10l。 (3) 在试验管中加入三种抗体各 20l。 (4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本 5l。 (5) 轻轻混匀，室温暗处孵育 15-20 分钟。 (6) 各管中加入 1ml 冷的固定液 (2-8C)，充分混匀， 2-8C 阴暗处放置 30 分 钟。 (7) 24 小时内上机分析。
质控标本 阴性对照（Isotype Control）：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体 特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同 时使用，以避免补偿造成的误差 血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控；使用正常人未活化标本 作为阴性质控 血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质 控；使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控 血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面 CD42a/CD42b 缺失，血小板无力 症血小板表面 gpIIb/IIIa， 即 CD41/CD61 缺失或异常。 使用正常人标本做阳性对照， 抗体的同型对照做阴性对照 血小板标本上机检测 仪器校正：由于试验室环境波动，会导致荧光有所波动，因此，需要对仪器进行校 正。配置 CaliBRITE 微球，使用 FACSComp 自动校正仪器 打开 CELLQuest 软件，调整数据获取条件：散射光和荧光均使用对数放大。调整 散射光电压，使血小板群位于点图中间位置。调整荧光电压，是对照管非特异荧光 位于坐下角。使用微球或样本调整补偿 数据获取：获取血小板 5000 个以上。 数据分析： 1. 设门： 1) FSC-SSC 点图中找出血小板，缺点是血小板较小，不易通过大小将碎片或 杂质完全分开
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血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析
前言 血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细 胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和 反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及 治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。 使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是： 检测血小板的反应性。 了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到 血小板外。 同时检测多种血小板表面标志。 高度灵敏。 直接检测血小板的多种标志。 使用全血，标本量少。 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。
附 2：血小板无力症的流式细胞分析
分析血小板的IIb/IIIa 复合物（CD61 或 CD41）及其活化结构。 准备阴性对照管、 阳性对照管和试验管， 进行染色： 阴性管中加入病人全血和 FITC 标记的同型对照； 阳性对照管加入正常人全血和抗体 CD41 FITC；试验管中加入病 人全血和抗体 CD41 FITC。 固定后上机： 1. 2. 3. FSC、SSC 和 FL1 均采用对数方式获取 FSC-SSC 设门，找到血小板细胞群 分析血小板细胞群的 FL1 直方图： 由阳性对照定界值， 报告试验管病人血小板 CD41 缺失的百分率
BDIS 血小板活化试剂组成为： PAC-1 FITC：早期血小板活化的标志物，即活化的 gpⅡb/Ⅲa 复合物， 抗体与活化后血小板膜表面的 gpⅡb/Ⅲa 复合物纤维蛋白原结合位点相结合。 BDIS 抗体为 IgM 型，建议使用 PAC-1 结合阻断剂 RGDS 做阴性对 照。 CD62P PE：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静 止血小板胞浆内颗粒含有 CD62P，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放， 血小板表面表达 CD62P。 CD61 PerCP：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与 未活化血小板结合。CD61 与 CD41 联合，即为血小板表面 gpⅡb/Ⅲa 复合物。 在本试验中，用 FL3 设阈值。
操作步骤
1.
标本采集： (1) 采血管顺序编号。 (2) 抽取静脉血，采血管中注入 2ml。 (3) 于 10 分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。
2.
血小板激活： (1) 试管内加入 50lADP，450l 全血，轻轻摇匀。 (2) 室温孵育 5 分钟。 (3) 立即染色。
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附 1：巨血小板症的流式细胞分析
分析血小板的 CD42a/CD42b。 准备阴性对照管、阳性对照管和试验管，进行染色：阴性管中加入病人全血和同型 对照及 CD61 PerCP； 阳性对照管加入正常人全血和抗体 CD42a FITC/CD41 PE； 试 验管中加入病人全血和抗体 CD42a FITC/CD41 PE。 固定后上机分析： 1. 2. 3. FSC、SSC 和 FL 均采用对数方式获取 FL2-SSC 设门，找到血小板细胞群 分析血小板细胞群的 FL1 直方图： 由阳性对照定界值， 报告试验管病人血小板 CD42a 缺失的百分率
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附：BDIS 血小板活化试剂
BD 抗体： CD PAC-1 CD62P CD61 Isotype 1 CaliBRITE 3 Ig Subclass IgM IgG1 IgG1 Form FITC PE PerCP PE Unlabeled,FITC,PE,PerCP Catalog No. 340507 348107 340506 340013 340486 Tests 50 100 50 25g 25
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2) 从 CD41 或 CD61-SSC 点图中画出血小板门，由于特异性高，可以有效地 去除碎片和杂质的干扰。
3) 巨血小板症的病人 CD42a/CD42b 缺失，与正常人做对照，判断抗原缺失情 况。若采用 FSC-SSC 设门，则正常人阳性对照的 CD42a 直方图中会有少 量阴性细胞，这些阴性细胞主要是门内含有的碎片和杂质，诊断时应考虑 这些背景干扰，如果阴性百分含量过高，就会影响诊断结果。如果采用 CD41-SSC 设门，就可以有效去除杂质干扰，正常人的 CD42a 直方图表现 为只有一个阳性峰。 2． 确定阳性细胞百分率：由阴性对照相应的直方图或点图确定阴性界值，由样本 管确定阳性百分率 3． 分析细胞抗体结合量： 使用 QuantiBRITE 系统， 检测血小板上结合的抗体含量。 适合应用在血小板活化试验中
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流式细胞术分析血小板
血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病生 理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞 仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术， 它拓宽了血小板相关疾病的诊断与 功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。 流式细胞仪血小板分析应用范围 通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子 的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测， 分析血小 板止血功能的获得性和遗传性缺陷 结合血小板大小，检测血小板 RNA 含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板 发现血小板抗体，做定性和定量分析
血小板分析的临床应用 血小板活化导致的血栓前综合症：如糖尿病、非免疫性血小板活化 血管缺陷导致的血小板活化：如动脉粥样硬化、急性心梗、血管成型术、心脏移植 血小板糖蛋白的基因缺失，或血小板存储缺陷导致的出血性疾病 骨髓异常增生或骨髓发育不良、肾衰末期、血小板输血或药物副作用引起的血小板 止血功能障碍 血小板相关的抗凝治疗的诊断监测 由特发性血小板减少或药物引发的血小板减少、 恶性肿瘤骨髓转移导致的血小板生 成减少 免疫性血小板减少、先兆子痫或脓毒症造成的血小板生成增加；生长因子治疗的骨 髓反应状况监测 自身免疫和同种免疫造成的血小板减少症
4.
上机获取数据： (1) 开机： 检查鞘液筒装满，废液筒倒空。 先打开流式细胞仪，再打开计算机。 仪器气路加压，排空气泡。 做 FACSComp。 调出 获取条件，FSC 和 SSC 选择 Log 方式。 获取条件为 CD61 PerCP 阳性。 使用对照管调整 FL1 和 FL2 的 PMT，使阴性群体位于 FL1 vs FL2 点图 左下角。 分别使用 PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP 和 PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP 调整 FL2-FL1 和 FL1-FL2 补偿。 获取各管的试验数据。
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全血样本的制备 1. 2. 3. 4. 抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程；做血小板活化试验 时，应尽量减少人为造成的血小板活化 Falcon 管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置 15 分钟 1%多聚甲醛固定样本 上机检测

RGDS (PAC-1 阻断剂)：用 PBS 配制，10mg/ml。 血小板激活剂：ADP，浓度 210 M，2-8C 保存。也可选用其他激活剂， 如 PMA、纤维蛋白、TRAP。
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PBS 缓冲液：含 0.1%NaN3，过滤后 2-8C 保存。 固定液：含 1%多聚甲醛的 PBS 缓冲液，2-8C 可保存一周。 振荡混匀器。 FACS 流式细胞仪：进行数据获取。 CaliBRITE Beads/FACSComp 软件：FACS 仪器校正，预设获取条件。 CellQuest 软件：试验数据获取和分态 全血中血小板更接近生理状态 操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变（如血小板活化试验） 同时检测血小板的多个标志物，结合 FSC 和 SSC，评估多个参数，进行定量分析 多采用血小板特异抗体 CD41 或 CD61 画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰 检测血小板亚群灵敏度高 用血量少 无放射性污染
(2) 打开 CellQuest，顺序放置对照管和试验管，获取数据：
5.
结果分析： 在 CD61 vs SSC 点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群，
CD61 阳性/低 SSC 一群主要由单个血小板组成，CD61 阳性/高 SSC 一群主要由黏附血小 板的血细胞组成， CD61 阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的 碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉， 因此，不建议使用 FSC-SSC 图设门。 在 CD61 vs SSC 点图中找出 CD61 PerCP 阳性的血小板群 (单个血小板和黏 附在 WBC 上的血小板)，设门。门内做 PAC-1 FITC vs CD62P PE 点图的双参数 分析，统计结果。
试验用品 采血管：枸橼酸钠抗凝的真空采血管。
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一次性 1275 mm Falcon 试管。 微量加样器和加样头。 BD 抗体：2-8C 保存。 荧光抗体 对照管 试验管 FITC PAC-1+RGDS PAC-1 PE IgG1 CD62P PerCP CD61 CD61