基因工程第三章分子克隆载体

2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子 遗传学观点来看是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式， 是生命起源研究的一块重要基石。 2）实践意义 是基因工程的重要载体，能把外源基因（目的 基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
①质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要 任务之一就是严格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个 致癌质粒可以传递就会传到外都是。 ②作为基因工程载体的3个特点：
4. 重组克隆的 “插入失活”筛选方法 插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr，在含有氨卞青霉素
培养基上可生长，在在含有四环素培养基上不生长； 插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps，在含有氨卞青霉
素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
4、可转移性
在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合 作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依 赖于质粒上的tra基因产物(移动基因mob、转移基因tra、顺 式作用元件bom及转移缺口位点nic)(接合型质粒 )。基因工 程中常用的质粒载体缺乏转移所需的基因（mob基因），不 能通过接合作用在细胞间传递，但可采用人工方法转化到细 菌细胞中(非接合型质粒 )。
按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基 因。选择标记用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功 转化了载体的宿主挑选出来，筛选标记可用于将特殊表型的 重组子挑选出来。 1、 选择标记基因
抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。 主要种类：
①抗氨卞青霉素(ampr)
氨卞青霉素抗性基因编码的酶可分泌进入细菌的周质区，
二、载体的报告基因(标记基因)
基因工程中利用载体上特意引入的一些具有特殊标志意 义的基因，用来证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目 的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。这 种具有标志意义的基因称为报告基因(report gene)，或标记 基因。
由于基因工程多用质粒作载体，质粒的报告基因在DNA 重组工作中具有重要意义，通过质粒的报告基因的表达可使 宿主细胞呈现一些可观察到的细胞生物学待征，通过质粒赋 予细胞的表型可识别和筛选重组体DNA的转化子细菌。
要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因） 通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工 具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具 就叫做载体（vector）。 载体: 能与外源DNA片断结合并将之传递到受体细胞而使之
复制表达的传递者。包括质粒、噬菌体、粘粒载体、 病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。 载体的功能：1、 运送外源基因高效转入受体细胞；
本章思考题： 1.列举质粒载体必须具备的4个基本特性。 2.什么叫穿梭载体？ 3. M13系列载体具有哪些优缺点? 4.黏粒载体具有哪些特点与不足? 5.质粒如何维持在细胞中的稳定？ 主要参考资料: 1.吴乃虎主编. 基因工程原理(第二版) .北京:科学出版 社,2002. 2.陆德如,陈永青主编．基因工程.化学工业出版社,2002 3.马建岗主编.基因工程学原理. 西安:西安交通大学出版 社,2001 4. [美] 本杰明∙卢因编著.基因Ⅷ.北京:科学出版社,2007.
第二节 λ 噬菌体载体
一、λ噬菌体的分子生物学特性
噬菌体是感染大肠杆菌的溶原性噬菌体，在感染宿主 后可进入溶原状态，也可进入裂解循环。 λ 噬菌体基因组 为长度约为 50kb 的双链 DNA 分子，λ噬菌体颗粒中DNA 为线状双链DNA分子，全长48502bp，两端各有一段长度为 12个核苷酸的互补单链（粘端），称为cos位点。当 噬菌 体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互 补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接 酶和旋促酶（gyrase）作用下，形 成封闭的环状 DNA 分子。
当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共
价闭合环形DNA(cccDNA)这样的
DNA通常呈现超螺旋的SC构型(c); 切割
连接
如果两条多核苷酸链中只有一条保
持着完整的环形结构，另一条链出
现有一至数个缺口时，称之为开环
DNA(ocDNA)，此即OC构型(b);若
质粒DNA经过适当的限制性核酸内 切割
2、 为外源基因提供复制能力或整合能力； 3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
基因工程中的载体应具有如下一些特性:
1、能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其 DNA中插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和 遗传特性。
2、在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点(最好是 单一酶切位点)，这些位点位于DNA复制的非必需区内， 可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载 体自身 DNA的复制。
并催化β -内酰胺环水解，从而解除氨卞青霉素毒性。
②抗四环素(tetr) ③抗氯霉素(cat) ④抗卡那霉素(kanr)或抗新霉素(neor)
2、筛选标记基因
筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外
源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选 插入了外源片段的质粒，即重组质粒。
连接
切酶切割之后，发生双链断裂而形
成线性DNA(IDNA)，通称L构型(a) 。
质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借 居”
宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响， 宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。
农杆菌质粒用p加Ti（Tumer inducing）或At （Agrobacterium tumefacions）表示，如pTiC58。
（一）克隆载体
克隆载体主要用于扩 增或保存 DNA 片段， 是最简单的载体。
1．pBR322
它由三部分组成： 来自ColEl的衍
生物pMBl的松弛复 制起点ori
2、质粒载体pUC19
2686bp
复制起始位点+1 个抗氨苄青霉素基 因+大肠杆菌乳糖 操纵子β-半乳糖苷 酶基因调节片断+ 阻遏蛋白基因
单一位点多
筛选方便：抗 Ampr和颜色反应
质粒缺乏控制拷贝 数的 rop 基因， 拷贝数达 500-700
（二）表达载体
该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的， 主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或 纯化的元件。
三、质粒载体的种类 质粒的命名
1、人工组建的质粒 人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）
的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的 作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。 例：pXYp109；pSC101 2、天然载体质粒
天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起 来。如（C01E1）。
A.都能独立自主的复制； B.都能便利的加以检测（抗生素抗性）； C.都能容易引进宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化 （提质粒）。 基因工程中主要使用人工构建的质粒。
1、自主复制性
质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控 制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体 DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不 同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制 酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的 多种酶群。
3、具有能够观察的表型特征(有报告墓因)，在插入外源 DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。即容 易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别 开来。
4、具有较高的拷贝数，便于载体的制备。
5、易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。
6、在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而 不易丢失。
严谨控制机理（低拷贝原因），认为 是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑 制自身DNA合成。
基因工程使用松弛型（高拷贝数） 质粒，以获得列多的基因产物。
*拷贝数（copy number)—细胞所含的按每一基因组计算的某种 质粒或基因的数目。
3、不相容性
利用同一复制系统的不同质粒如果被导入同一细胞中， 它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争， 它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快， 结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有 占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留 在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。
噬菌体生物学特性： 生物结构
溶菌控制基因
cos
晚期控制基因
DNA合成控制基因 阻遏基因
早期控制基因
- DNA
阻遏基因
重组基因 删除与整合基因
COS 3’ 5’ TCCAGCGGCGGG
48502bp
头部合成基因
尾部合成基因
CCCGCCGCTGGA 5’ 3’
λ噬菌体有61个基因，根据执行功能的不同可将基因组分 为三个区图3-9 。左边区域包括从基因 Nul到基因 J之间的基 因，其产物用于噬菌体 DNA 的包装和噬菌体颗粒的形成。中 间区域（基因 J 右边至 gam）编码基因调节、溶源状态的发 生和维持以及遗传重组所需要的基因。其中许多基因对裂解 生长是非必须的，并不影响噬菌体的增殖，在构建载体时可 以去掉，用外源 DNA 片段替代。右边区域（基因 gam右边 至基因 Rz）包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必须的基因。
①α-互补
是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整 的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互 补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实
现功能互补而建立的。
质粒
载体
N
②插入失活 通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具
有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两 种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基 因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素 是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。