仪器分析--平面色谱法

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50-17
氧化铝吸附活性：与含水量有关，水分增加， 等级增大，活性降低。
硅胶 含水量%
0 5 15
25 38
活性 等级
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅳ Ⅴ
氧化铝
含水量% 活化温度
0 3
300－400℃
6
150－300℃
10
15
100－150℃
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国药典》2010版中许多药物采用此法。
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50-12
一、薄层色谱的固定相
吸附剂，adsorbent 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
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50-13
1. 硅胶（SiO2·H2O，silica gel）
结构：内部— 硅氧交联结构→多孔结构 表面— 硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
适用范围：硅胶具有微酸性，适于分析酸性或中 性物质
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50-14
基本特性：
① 易形成氢键：与极性物质或不饱和化合物。物质 极性↑，吸附能力↑，不易洗脱。
② 吸附活性次序：活泼型>束缚型>游离型 ③ 吸附活性等级：与含水量有关，含水高，活性级
数高，吸附能力弱。
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50-2
二、平面色谱法参数
1、定性参数 ① 比移值（retardation foctor）
Rf = L / L0
可用范围：0.2～0.8 最佳范围：0.3～0.5
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50-3
② 相对比移值(relative Rf )： Rr＝Rf（i）/Rf（s）＝Li /Ls
种类
特性
使用范围
碱性 混有碳酸钠等成分而 氧化铝 具碱性，pH约为9~10
适合中性或碱性化合物的分 离。尤其适合分离生物碱等 碱性成分
中性 氧化铝
除去碱性成分水洗至 中性而得，pH约为
7~7.5
酸性 用稀硝酸或稀盐酸处 氧化铝 理而成，pH约为4~5
适合于对酸碱性不稳定的化 合物
中和了碱性杂质，并带有 NO3—或Cl—，具一定的离子 交换剂的性质，适于酸性成 分的柱色谱。
（2）点样方式
点状点样：
方法一，借助毛细管进行点样 方法二，借助注射器式点样器进行点样 方法三，借助于点样仪器进行点样
带状点样：斑点分辨率高、精密准确，适合 定量。 自动点样：自动点样仪
可由电脑和相应的软件控制吸样、点样、清洗 等全过程，
可点状、带状及方形点样。点状为接触式点样， 带状和方形为喷雾式点样。
平面色谱法
格物致知，厚德载物
19.1 平面色谱法的分类和原理
一、平面色谱法的分类：
① 薄层色谱法（TLC）：将固定相于惰性硬质 板上涂成一薄层，在此薄层上进行色谱分离 的方法。 其原理同柱层析。
② 纸色谱法：属分配色谱法，固定相为吸附于 滤纸上的水分，流动相一般为不与水混溶的 有机溶剂。
③ 薄层电泳法：带电荷的被分离物质（如蛋白、 核苷酸、多肽、糖类等）在惰性的支持介质 （如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶等）上， 以不同泳动速度向相反电极方向移动而分离。
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50-51
（2）内标法
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50-52
（3）归一化法
组 分i的 含 量 ＝
Ai
的Rf＝0和Rf＝1的组分的半峰宽
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50-7
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50-8
19.2 薄层色谱法
薄层色谱法的主要类型
吸附薄层色谱法：s－固体吸附剂 分配薄层色谱法：s－吸留在载体表面的 固定液和吸水达17% 以上的硅胶。
经典薄层色谱法 现代薄层色谱法
水溶液装柱上样：水使组分与聚酰胺之间形成氢 键的缔合能力增强，有利于聚酰胺对组分的充分 吸附。
常见溶剂对聚酰胺柱色谱的洗脱能力的顺序：水 ＜甲醇＜丙酮＜氢氧化钠水溶液＜甲酰胺＜二甲 基甲酰胺＜尿素水溶液。
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50-20
二、展开剂(developer)
1、选择原则： 三角律*
50-41
四、薄层色谱的定性分析
2. 斑点显色特征法：保存彩色图谱
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50-42
四、薄层色谱的定性分析
3. 薄层扫描法鉴别： （1）斑点的原位光谱扫描定性
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50-43
（2）薄层色谱的全程扫描定性
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H
H
H
H
大于600℃
O
O
硅胶表面
Si O Si O Si O Si
O
O
O
O
O
O
O
O
硅胶表面
Si O Si O Si O Si
O
O
O
O
Si O Si O Si O Si
Si O Si O Si O Si
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50-16
2. 氧化铝
由氢氧化铝在400～500℃灼烧而成
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50-21
2、常用溶剂极性强弱顺序： 水>酸>吡啶>乙腈>甲醇>乙醇>正丙醇>正丁 醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷> 甲苯>苯>三氯乙烷>四氯化碳>环己烷>石油 醚
3、展开剂选择：
单一溶剂和多元溶剂系统，根据分离情况通 过多次实验去选择。
理想展开剂要求达到：
50-11
薄层色谱法的特点
① 分离能力强，斑点集中； ② 灵敏度高，几十ng～几μg即可检出； ③ 速度快，几至几十min，一次可展开多个试样； ④ 试样处理简单，对被分离物质性质没有限制； ⑤ 上样量比较大，可以点状或条状点样； ⑥ 仪器简单，操作方便，可保留彩色图谱。 ⑦ 应用广泛，尤其对药物的鉴别，《中华人民共和
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50-47
1、薄层扫描定量分析的基本原理
（1）薄层吸收扫描法的原理：郎伯比耳定律
透射比反射线性关系好
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50-48
（2）薄层荧光扫描法的基本原理：
F I0abc
φ为效率常数； a为吸光系数； b为薄层斑点厚度
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பைடு நூலகம்
50-27
点样器与点样效果
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50-28
点样前需注意：确认板的清洁
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50-29
3、展开
（1）展开方式：
一维单向展开： 二维双向展开： 强迫流动展开
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50-23
制板设备和仪器
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50-24
2、点样
（1）点样要求：
合适的溶剂
样品浓度 点样量 点样位置 样点大小 样点间隔
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50-25
不同溶剂对斑点展开前后的影响
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50-26
50-18
3. 聚酰胺（polyamide）
聚酰胺（polyamide）为高分子聚合物。属氢键吸 附作用原理
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50-19
聚酰胺的性质：聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、 乙醚、氯仿和丙酮等常用溶剂，对碱比较稳定。 但对酸，尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐 酸、冰乙酸和甲酸中。
重现性和可比性较 Rf 好
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50-4
2、相平衡参数— K 和k 与Rf 的关系 Rf ＝ 1/(1+ k)＝1/(1 + KVs/Vm)
k , K＝0，Rf ＝1 k , K＝∞，Rf ＝0
3、面效参数— n和H
理论塔板数n：n ＝ 16 ( L/W ) 2 塔板高度 H： H ＝ L0/n
50-30
一维单向展开方式
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50-31
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50-32
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50-33
（2）影响展开的因素和注意事项
①环境的相对湿度
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50-34
（2）影响展开的因素和注意事项
Rf 与R’类似
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50-5
4、分离参数 ① 分离度(resolution，R):
两相邻斑点中心距离与两斑 点平均宽度的比值。
R = 2(L2－L1) /(W1 + W2)
=2d /(W1 + W2) 在平面色谱中，R 应大于1
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50-9
modern TLC
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50-10
薄层色谱法的一般流程
固定相、载体选择 和薄层板的制备
薄层板的 预处理
样品制备
色谱前 衍生化
点样 展开
薄层板 预平衡
斑点定位
定性 定量
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②溶剂蒸气的影响：
薄层色谱是固定相、液态展开剂相及展开室内 的蒸气相共同构成的一个复杂的色谱分离过程。 展开室内三相之间达到平衡的程度即饱和
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50-35
饱和操作的必要性：重现性与克服边缘现象
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50-36
③ 温度： ④ 展开方式： ⑤ 展距： ⑥ 展开室的放置：
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50-37
4、展开结束与斑点定位
结束展开：展距合适、标前沿、除溶剂 斑点定位方法：
可见光下观察 紫外灯下观察 显色剂显色： 通用：10% 硫酸乙醇溶液；碘蒸气； 专用：碘化铋钾 —生物碱；
三氯化铁 —黄酮； 茚三酮 — 氨基酸
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Rf = 0.3～0.8,ΔRf ≥0.05
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50-22
三、薄层色谱操作方法
制板→点样→展开→显色→分析 1、薄层板的制备：
软板、硬板，自制或购买商品板 板材：玻璃、锡箔纸、塑料 规格： 涂铺：无气泡、匀浆、均匀、厚250μm 活化：
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④ 活化与失活：吸水→失活→105～110OC烘干3060min( 可 逆 失 水 )→ 吸 附 力 最 大 →500OC 烘 干 ( 不 可逆失水)→活性丧失，无吸附力。
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50-15
H2O
H2O
H2O
H2O
H2
O H2
O
OH
OH
OH
O H2
H2O
OH硅胶表面
50-44
（3）薄层的三维扫描光谱图定性
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50-45
（4）与其他方法联合定性 TLC-MS联用仪：
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50-46
五、定量分析
定量分析：半定量和定量
半定量方法：估计含量，如限量检查； 定量方法：
间接定量—— 洗脱测定 直接定量—— 薄层扫描测定：主要包括吸 收扫描法和荧光扫描法
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50-49
2、薄层色谱扫描法定量分析方法
（1）外标法
① 外标一点法：
A样 = m样 A标 m标
② 外标二点法：
m样＝a bA样
a m1 bA1，b
m1 m2 A1 A2
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50-50
③ 回归方程计算法：
50-38
浸 渍 槽
生物自显影检测系统
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50-39
光学检测定位仪器
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50-40
四、薄层色谱的定性分析
1. 斑点比移值对照法：在多种展开系统中，与 标
准物质进行R f 值比较。
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50-6
② 分离数（seperation number，SN）：
定义：在相邻斑点分离度为1.177时，在Rf 为0和 1.0之间能完全分离的组分斑点数。
SN越大，平面的容量越大，一般薄层板的 SN 在10 左右，高效薄层板可达20。
计算SN:
SN =
L0
－1
(W1/2 )0 + (W1/2 )1
(W1/2)0、(W1/2)1分别为由薄层色谱扫描所得
Si O Si
O
O
Si O Si
O Si O
O Si
O Si O
O Si
加热 H2O
OH Si O O
OH Si O O
OH
OH
硅胶表面
Si O Si
O
O
Si O Si O Si O Si
HO
H
O
O 硅胶表面
Si O Si O Si O Si
O
O
O
O
大于200℃
H2O 低于200℃
Si O Si O Si O Si