不同连作年限温室草莓根际土壤性质及真菌群落特征分析

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(１２):１０３~１１１ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.１２.０１４
收稿日期:２０２３－０１－１９
基金项目:河南省重点研发与推广专项(２１０５１０３９)ꎻ河南省高等职业学校青年骨干教师培养项目(２０２０ＧＺＧＧ００１)ꎻ河南农业职业学院科
研创新团队项目(ＨＮＡＣＫＴ－２０２０－０６)
作者简介:田春丽(１９８２ )ꎬ女ꎬ河南驻马店人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事植物营养学㊁土壤化学与土壤微生物领域的教学与研究ꎮＥ－
ｍａｉｌ:５１１３６２９７３＠ｑｑ.ｃｏｍ
通信作者:远兵强(１９８３ )ꎬ男ꎬ河南遂平人ꎬ硕士ꎬ讲师ꎬ主要从事土壤微生态研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｇ２３９＠１２６.ｃｏｍ
不同连作年限温室草莓根际土壤性质
及真菌群落特征分析
田春丽ꎬ远兵强ꎬ姚丽娟ꎬ校彦赟
(河南农业职业学院农业工程学院ꎬ河南中牟㊀４５１４５０)
㊀㊀摘要:土壤真菌在土壤生态环境中起着至关重要的作用ꎬ长期单作或连作会导致土壤真菌群落结构发生变化ꎮ为研究长期连作对草莓植株健康和根际真菌群落组成的影响ꎬ采用ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ测序技术ꎬ比较分析未连作(ＣＫ)和不同连作年限(１㊁２㊁４㊁７㊁９㊁１１年)温室草莓根际土壤性质及真菌群落的结构特征ꎮ结果表明ꎬ草莓连作后土壤理化性质发生显著变化ꎬ连作４年后养分含量开始明显下降ꎮ高通量测序表明ꎬ土壤真菌群落丰富度和多样性随连作年限增加而增加ꎬ土传病害菌镰刀菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)㊁腐质霉属(Ｈｕｍｉｃｏｌａ)㊁久浩酵母属(Ｇｕｅｈｏｍｙｃｅｓ)丰度显著增加ꎬ斗管囊霉属(Ｆｕｎｎｅｌｉｆｏｒｍｉｓ)㊁节丛孢属(Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ)丰度从连作第４年开始下降ꎮＳｐｅａｒｍａｎ相关性分析表明ꎬ土壤ｐＨ值㊁速效钾和速效氮是判定草莓连作系统中有益菌群与致病菌群结构的主要因素ꎮＲＤＡ分析表明ꎬｐＨ值㊁速效氮是决定连作系统中Ｆｕｎｎｅｌｉｆｏｒｍｉｓ㊁Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ丰度的主要土壤因子ꎻ速效钾是影响Ｇｕｅｈｏｍｙｃｅｓ㊁Ｈｕｍｉｃｏｌａ㊁Ｆｕｓａｒｉｕｍ丰度的主要土壤因子ꎮ本研究结果可为草莓种植的可持续发展及连作土壤治理提供理论依据ꎮ
关键词:草莓连作ꎻ根际土壤ꎻ真菌群落ꎻ土壤理化性质ꎻ冗余分析
中图分类号:Ｓ６６８.４０６＋.１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)１２－０１０３－０９
ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＲｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅＳｏｉｌＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄ
ＦｕｎｇａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｙＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＧｒｅｅｎｈｏｕｓｅＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ
ｉｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓＣｒｏｐｐｉｎｇＹｅａｒｓ
ＴｉａｎＣｈｕｎｌｉꎬＹｕａｎＢｉｎｇｑｉａｎｇꎬＹａｏＬｉｊｕａｎꎬＸｉａｏＹａｎｙｕｎ
(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＺｈｏｎｇｍｕ４５１４５０ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｓｏｉｌｆｕｎｇｉｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｓｏｉｌｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ.Ｉｎａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎬｌｏｎｇ￣
ｔｅｒｍｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｃａｎｌｅａｄｔｏｃｈａｎｇｅｓｉｎｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｏｎｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｐｌａｎｔｈｅａｌｔｈａｎｄｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉ￣ｔｉｏｎａｒｅｓｔｉｌｌｕｎｃｌｅａｒ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅＩｌｌｕｍｉｎａ￣ＭｉＳｅｑｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗａｓｕｓｅｄꎬａｎｄｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｂｅｔｗｅｅｎｎｏｎ￣ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇ(ＣＫ)ａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｙｅａｒｓ(１ꎬ２ꎬ４ꎬ７ꎬ９ꎬ１１ａ)ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｏｉｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｃｈａｎｇｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｔｅｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｏｆｓｔｒａｗｂｅｒｒｙꎬａｎｄｔｈｅｓｏｉｌｎｕｔｒｉｅｎｔｃｏｎ￣
ｔｅｎｔｂｅｇａｎｔｏｄｅｃｒｅａｓｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｔｅｒ４￣ｙｅａｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇ.Ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｉｃｈｎｅｓｓａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｓｏｉｌｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ
ｃｒｏｐｐｉｎｇｙｅａｒｓ.ＳｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙꎬｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＦｕｓａｒｉｕｍꎬＨｕｍｉｃｏｌａａｎｄＧｕｅｈｏｍｙｃｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆ￣ｔｅｒｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇꎬｗｈｉｌｅｔｈａｔｏｆＦｕｎｎｅｌｉｆｏｒｍｉｓａｎｄＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍｔｈｅ４ｔｈｙｅａｒｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇ.ＳｐｅａｒｍａｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｏｉｌｐＨꎬａｖａｉｌａｂｌｅｐｏｔａｓｓｉｕｍａｎｄａｖａｉｌａｂｌｅｎｉ￣ｔｒｏｇｅｎｗｅｒｅｔｈｅｍａｉｎｆａｃｔｏｒｓｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎｓｔｒａｗ￣ｂｅｒｒｙｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｓｙｓｔｅｍ.Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬｔｈｅｒｅｄｕｎｄａｎｃｙａｎａｌｙｓｉｓ(ＲＤＡ)ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｏｉｌｐＨａｎｄａｖａｉｌａｂｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎｗｅｒｅｔｈｅｍａｉｎｆａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＦｕｎｎｅｌｉｆｏｒｍｉｓａｎｄＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｉｎｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎬａｎｄａｖａｉｌａｂｌｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｗａｓｔｈｅｍａｉｎｓｏｉｌｆａｃｔｏｒａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＧｕｅ￣ｈｏｍｙｃｅｓꎬＨｕｍｉｃｏｌａａｎｄＦｕｓａｒｉｕｍ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｆｏｒｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｐｌａｎｔｉｎｇａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｓｏｉｌｍａｎａｇｅｍｅｎｔ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇꎻＲｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌꎻＦｕｎｇｉｃｏｍｍｕｎｉｔｙꎻＳｏｉｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓꎻＲｅ￣ｄｕｎｄａｎｃｙａｎａｌｙｓｉｓ
㊀㊀草莓(ＦｒａｇａｒｉａａｎａｎａｓｓａＤｕｃｈ.)为蔷薇科草莓属多年生草本植物ꎬ是全球广泛种植的水果之一[１]ꎬ果实含有大量维生素㊁糖酸㊁鞣酸㊁氨基酸㊁果胶及微量元素ꎬ具有明目养肝㊁滋补调理㊁改善便秘及抗衰老等功能ꎬ表现出极高的营养㊁药用及观赏价值[２]ꎬ深受消费者喜爱ꎮ优质草莓的规模化生产严重依赖于栽培方式ꎬ且草莓为温度敏感型浆果类植物ꎬ在栽培过程中常常需起垄覆膜㊁隔离搭棚ꎬ在栽培初期劳动力和资金投入量大[３]ꎬ这意味着设施一旦建成ꎬ几年甚至十几年的连作便成为草莓生产的常规栽培方式ꎮ然而ꎬ长期连作经常导致草莓品质及产量大幅下降ꎬ炭疽病㊁疫病㊁叶斑病及镶脉病毒等发生[４]ꎮ
大量研究表明ꎬ连作会导致土壤微生物群落结构发生变化㊁土壤理化性质恶化以及病原微生物和有益微生物丰度失衡ꎬ土壤性质和土壤微生物种群的变化会直接或间接影响连作系统作物的产量和品质[５]ꎮ微生物群落是土壤生态系统的组成部分ꎬ在许多生物过程中发挥着至关重要的作用ꎬ包括Ｃ㊁Ｎ㊁Ｐ和Ｓ循环以及为植物提供养分[６]ꎮ此外ꎬ土壤理化性质和微生物多样性可相互影响ꎬ微生物可以促进土壤养分元素的周转ꎬ而良好的理化环境可以促进微生物的生长和代谢[７]ꎮ土壤微生物多样性的变化是影响连作的重要因素ꎬ土壤中的动植物残留物可通过微生物降解转化为土壤有机质ꎬ而微生物会直接或间接影响植物对养分的吸收[７]ꎮ此外ꎬ由于土壤微生物对环境压力或自然扰动导致的细微环境差异敏感ꎬ因此可作为土壤质量的表征指标ꎮ有研究表明ꎬ相对于土壤细菌群落ꎬ连作后真菌群落多样性的变化更为明显[８]ꎬ而特定真菌的丰度变化会引起作物的土壤传播疾病ꎮ
在过去几十年中ꎬ磷脂脂肪酸法㊁平板计数法㊁脂肪酸甲酯法㊁变性梯度凝胶电泳及末端限制性片段长度多态性是探索土壤微生物群落结构的主要方法ꎮ随着分子生物学的发展ꎬ宏基因组中的ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ平台为微生物群落结构分析提供了更深㊁更全面㊁更高效快捷的途径[９]ꎮ目前ꎬＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ已越来越多地用于连作系统中土壤细菌和真菌群落结构㊁多样性和组成的分析[１０]ꎮ然而ꎬ草莓连作造成土壤微生物生态特别是真菌群落生态连续变化的研究仍鲜有报道ꎮ基于此ꎬ本研究利用ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑＰＥ３０００测序平台分析了不同连作年限的草莓根际土壤真菌内部转录间隔区(ＩＴＳ)的组成和进化关系ꎬ探讨土壤真菌多样性与土壤因子间的内在联系ꎬ以期为草莓可持续发展及连作土壤的规模化治理提供理论依据ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀试验区概况
试验地位于河南省中牟现代高新农业科技示范区(雁鸣湖新市镇ꎬ１１４ʎ１１ᶄ４４ᵡＥꎬ３４ʎ７３ᶄ２５ᵡＮ)ꎬ海拔７８１ｍꎬ暖温带大陆性季风气候ꎬ年均日照２３６５ｈꎬ年均降水量６１９ｍｍꎬ年均气温１４.３ħꎬ无霜期２４０ｄꎮ该园区草莓园占地６.３ｈｍ２ꎬ建成于２０１０年５月ꎬ土壤类型为黄褐土ꎬ质地中壤ꎮ
４０１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
０~２０ｃｍ土壤理化性质为ｐＨ８.０３ꎬ有机质１９.７９ｇ/ｋｇ㊁全氮０.８６ｇ/ｋｇ㊁速效氮７８.７５ｍｇ/ｋｇ㊁有效磷２３.８４ｍｇ/ｋｇ㊁速效钾１４５.２８ｍｇ/ｋｇꎮ
１.２㊀试验设计与方法
草莓品种 红颜 种植于玻璃温室ꎮ每个温室分隔为３个田块ꎬ每个田块均由２５个苗床组成ꎮ苗床长２０ｍꎬ宽５０ｃｍꎬ高４０ｃｍꎮ每床种植２行ꎬ行距２０ｃｍꎮ选择种植年限分别为１㊁２㊁４㊁７㊁９㊁１１年的温室ꎬ相邻新建温室为对照(ＣＫ)ꎬ每一连作年限的温室选取３块种植田作为重复ꎮ每年施入６０００ｋｇ/ｈｍ２农家肥和５７５ｋｇ/ｈｍ２草莓专用肥(ＮʒＰ２Ｏ５ʒＫ２Ｏ＝１７ʒ９ʒ２２)ꎬ采用滴灌方式补充水分ꎮ
１.３㊀样品采集及测定分析
１.３.１㊀土壤样品采集与处理㊀２０２１年１２月采集土壤样品ꎮ每个种植区按照五点取样法采样ꎬ去除０~０.５ｃｍ的表层土壤ꎬ从０.５~２０ｃｍ深的土壤中将草莓根系挖出ꎬ收集距离根系０.２ｃｍ的土壤ꎬ同一田块的土壤充分混合[１１]后分为两部分:一部分保存于－８０ħ冰箱用于土壤ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ分析ꎬ一部分自然风干后研磨过２ｍｍ筛用于土壤理化性质分析ꎮ
１.３.２㊀土壤理化性质测定㊀土壤指标的测定按照鲍士旦[１２]的方法进行ꎮ利用ｐＨ计(ＦＥ２０－ＦｉｖｅＥａｓｙＰｌｕｓＴＭꎬＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)测定土壤ｐＨ值(水ʒ土＝２.５ʒ１)ꎬ采用重铬酸钾(Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７)氧化还原滴定法测定土壤有机质含量ꎬ土壤全氮㊁速效氮㊁有效磷㊁速效钾含量分别采用半微量凯氏定氮法㊁碱解扩散法㊁０.５ｍｏｌ/ＬＮａＨＣＯ３浸提分光光度法㊁ＮＨ４ＯＡｃ浸提－火焰光度法测定ꎮ
１.３.３㊀连作土壤真菌群落分析㊀土壤基因组ＤＮＡ的提取㊁纯化及ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ测序:称取－８０ħ保存的土壤样品５００ｍｇꎬ使用土壤ＤＮＡ试剂盒(Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈꎬＧｅｒｍａｎｙ)提取基因组ＤＮＡꎬ使用分光光度计测定ＤＮＡ纯度和浓度ꎬ并使用０.８％琼脂糖凝胶测定其完整性以获得高质量ＤＮＡ提取物的等分试样(４０μＬ)用于进一步分析ꎮＰＣＲ扩增微生物１８ＳｒＲＮＡ基因的真菌内转录间隔区(ＩＴＳ)ꎬ反应条件为:９５ħ２ｍｉｎꎻ９５ħ１５ｓꎬ５０ħ２０ｓꎬ７２ħ延伸１０ｍｉｎꎬ循环数为２８ꎮ反应体积为５０μＬꎬ包含２μＬ(３０ｎｇ)模板ＤＮＡꎬ２μＬＩＴＳ１－Ｆ正向引物(ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴ￣ＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ)㊁２μＬＩＴＳ２－Ｒ反向引物(ＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ)㊁４μＬｄＮＴＰｓ(２.５ｍｍｏｌ/Ｌ)㊁５μＬ１０ˑＰｙｒｏｂｅｓｔ缓冲液㊁０.３μＬＴａＫａ￣ＲａＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ聚合酶(２.５Ｕ/μＬ)和３４.７μＬｄｄＨ２Ｏ[１３]ꎮ２.０％琼脂糖凝胶电泳获取ＰＣＲ产物ꎬ并利用ＱＩＡｑｕｉｃｋ凝胶提取试剂盒(ＱＩＡＧＥＮꎬＣｒａｗｌｅｙꎬＵＫ)进行纯化ꎮ使用ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ(Ｐｒｏ￣ｍｅｇａꎬＵＳＡ)对ＤＮＡ进行定量分析ꎮ
ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ测序及数据处理:纯化定量后的ＤＮＡ产物采用ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑＰＥ３０００平台进行双端测序ꎮ使用ＱＩＩＭＥ软件包的Ｐｒｅｃｌｕｓｔｅｒ工具过滤测序文库ꎬ使用滑动过滤(Ｐｈｒｅｄ<２０)去除低于５０ｂｐ的序列读数ꎬ组装长度大于１０ｂｐ的重叠序列ꎮ使用ＵＣＨＩＭＥ和ＵＰＡＲＳＥ(ｈｔｔｐ://ｄｒｉｖｅ５.ｃｏｍ/ｕｐａｒｓｅ/)识别和删除嵌合序列ꎮ通过ＲＤＰ分类器(ｈｔｔｐ://ｒｄｐ.ｃｍｅ.ｍｓｕ.ｅｄｕ/)对ＩＴＳ基因序列进行物种分类注释ꎬ使用７０％的置信度阈值与ＵＮＩＴＥ(７.０)的ＩＴＳ数据库进行归一化分析[１４]ꎮ利用Ｍｏｔｈｕｒ软件统计每个样本的真菌α－多样性指数ꎮ借助Ｒ语言对测序数据与土壤因子进行冗余分析(ＲＤＡ)ꎮ以上测序与分析委托广州锐博生物科技有限公司完成ꎮ
１.４㊀数据处理与统计分析
采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１３软件进行数据整理ꎬ采用ＳＰＳＳ２２.０软件(ＩＢＭＳＰＳＳＩｎｃ.ꎬＣｈｉｃａ￣ｇｏꎬＩＬ)进行邓肯氏多重比较分析(α＝０.０５)ꎬ采用Ｒ软件和Ｏｒｉｇｉｎ８软件绘制相关图形ꎮ
２㊀结果与分析
２.１㊀不同连作年限草莓根际土壤理化性质如表１所示ꎬ随着草莓种植连作年限的延长ꎬ土壤ｐＨ值逐渐降低ꎬ范围为７.１５~８.１４ꎬ连作１１年的ｐＨ值最低ꎮ连作４年的草莓根际土壤全氮含量最大ꎬＣＫ最小ꎬ全氮含量范围为１.０５~１.５６ｇ/ｋｇꎻ从连作第４年开始ꎬ随着连作年限的增加ꎬ速效氮含量降低ꎮ土壤有机质含量呈先升高后降
５０１
㊀第１２期㊀㊀㊀田春丽ꎬ等:不同连作年限温室草莓根际土壤性质及真菌群落特征分析
低趋势ꎬ含量范围为２１.６８~３０.２３ｇ/ｋｇꎬ且在连作４年后显著降低ꎮ连作草莓根际土壤中有效磷含
量较ＣＫ显著提高２８.４２％~１６９.４２％ꎮ各处理速效钾含量变化趋势与有效磷趋于相反ꎮ
㊀㊀表１㊀
不同连作年限草莓根际土壤理化性质
连作年限ｐＨ值全氮/(ｇ/ｋｇ)
速效氮/(ｍｇ/ｋｇ)
有机质/(ｇ/ｋｇ)
有效磷/(ｍｇ/ｋｇ)
速效钾/(ｍｇ/ｋｇ)
０(ＣＫ)８.１１ʃ０.０８ａ１.０５ʃ０.０１ｅ８２.０３ʃ１.２１ａ２１.６８ʃ０.２４ｅ１４.７８ʃ１.１１ｄ２３１.３１ʃ１.１１ａ１８.１４ʃ０.０７ａ
１.４１ʃ０.０２ｂ８１.５４ʃ２.０５ａ２８.８２ʃ０.４９ａｂ３０.１７ʃ１.１７ａｂ
１８３.５７ʃ３.１９ｃ２７.７６ʃ０.０５ｂ１.４１ʃ０.０４ｂ８１.９７ʃ０.８４ａ３０.２３ʃ０.９１ａ３９.８２ʃ１.９５ａ１９２.７８ʃ３.２９ｂ４７.６４ʃ０.１１ｂ１.５６ʃ０.０５ａ７６.８６ʃ１.２９ｂ２８.３５ʃ０.２２ｂ３５.４３ʃ０.７３ａ１５１.４１ʃ１.１７ｄ７７.３０ʃ０.０８ｃ１.２４ʃ０.０２ｃ７５.６４ʃ０.４４ｂ２１.９１ʃ０.２５ｅ３７.２９ʃ１.４２ａ１５２.８６ʃ２.１２ｄ９
７.２４ʃ０.０８ｃ１.１３ʃ０.０５ｄ７２.４７ʃ０.５６ｃ２４.４４ʃ０.４２ｃ２３.７２ʃ０.８４ｂｃ１４３.０８ʃ１.２６ｅ１１７.１５ʃ０.１３ｃ１.０８ʃ０.０４ｄ
７２.１９ʃ１.０４ｃ２３.７５ʃ０.１５ｄ
１８.９８ʃ１.６１ｃ１２８.５３ʃ０.９２ｆ㊀㊀注:同列数据后不同小写字母表示不同连作年限间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ
２.２㊀不同连作年限草莓根际土壤真菌群落的Ａｌ￣ｐｈａ多样性指数
由图１Ａ可知ꎬＳｈａｎｎｏｎ指数在各处理中表现
为ＣＫ<２年<１年<４年<７年<９年<１１年ꎬ且ＣＫ显著小于连作４年以上的处理ꎮ由图１Ｂ可知ꎬ各处理Ｓｉｍｐｓｏｎ指数变化规律与Ｓｈａｎｎｏｎ指数相反ꎬ即ＣＫ的Ｓｉｍｐｓｏｎ指数最高ꎬ随着草莓连作年
限的延长ꎬＳｉｍｐｓｏｎ指数整体呈下降趋势ꎮ在真菌丰富度指数(Ｃｈａｏ１㊁Ａｃｅ)中ꎬ各处理均呈ＣＫ<１年<２年<４年<７年<９年<１１年ꎬ且４㊁７㊁９㊁１１年丰富度指数均显著大于ＣＫ(图１Ｃ㊁Ｄ)ꎮ以上结果表明ꎬ连作会改变草莓根际土壤真菌群落的Ａｌ￣ｐｈａ多样性ꎬ且在连作４年后土壤真菌丰富度和
多样性增加
ꎮ
柱上不同小写字母表示不同连作年限间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ
图１㊀不同连作年限土壤真菌群落丰富度和多样性
６０１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
２.３㊀草莓根际土壤真菌群落Ａｌｐｈａ指数与土壤性质的关系
草莓根际土壤真菌群落Ａｌｐｈａ多样性指数与土壤理化性质的相关性分析见表２ꎮＡｌｐｈａ多样性指数与土壤理化性质存在显著相关性的指标主要为ｐＨ值㊁速效氮和速效钾ꎮ其中Ｓｈａｎｎｏｎ指数与ｐＨ值㊁速效氮㊁速效钾呈显著负相关(Ｐ<０.０５)ꎻＳｉｍｐｓｏｎ指数与ｐＨ值㊁速效氮呈显著正相关(Ｐ<０.０５)ꎬ与速效钾呈极显著正相关(Ｐ<０.０１)ꎻＣｈａｏ１㊁Ａｃｅ指数与ｐＨ值㊁速效氮㊁速效钾均呈极显著负相关(Ｐ<０.０１)ꎮ
㊀㊀表２㊀㊀草莓根际土壤真菌群落多样性与
土壤性质的相关性
指标ｐＨ值全氮速效氮有机质有效磷速效钾Ｓｈａｎｎｏｎ－０.７２∗－０.３４－０.８１∗－０.２０－０.２４－０.８３∗Ｓｉｍｐｓｏｎ０.７９∗０.０４０.８２∗－０.０８－０.０９０.９３∗∗Ｃｈａｏ１－０.８５∗∗－０.１４－０.８６∗∗－０.０４０.０３－０.９２∗∗Ａｃｅ－０.９２∗∗－０.０９－０.９１∗∗－０.０２０.２１－０.９８∗∗㊀㊀注:∗㊁∗∗分别表示在０.０５㊁０.０１水平上显著相关ꎮ
２.４㊀不同连作年限草莓根际土壤真菌群落分类与组成
２.４.１㊀不同连作年限草莓根际土壤真菌门水平群落结构特征㊀本研究分析了７个不同连作年限处理共２１个土壤样品ꎬ经过ＤＮＡ提取㊁纯化及ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑＰＥ３００平台测序共获得１７５３７０６个Ｃｌｅａｎ序列ꎬ基于９７％序列相似性聚类得到２６２３个ＯＴＵｓꎬ通过ＲＤＰ对基因序列及ＱＩＩＭＥ的默认设置进行分类(门到属)及物种注释ꎬ可划分为８门㊁２８纲㊁８７目㊁１８０科㊁３７７属ꎮ所有土壤样品中的主要门类包括子囊菌门(Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａꎬ６４.３７％~８７.０１％)㊁担子菌门(Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａꎬ１.７２％~１０.７５％)㊁接合菌门(Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａꎬ１.８１％~７.４４％)㊁壶菌门(Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａꎬ０.５７％~９.６１％)和球囊菌门(Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａꎬ０.６１％~９.４３)ꎬ见图２ꎮ
２.４.２㊀不同连作年限草莓根际土壤真菌属水平群落结构特征㊀图３显示了平均相对丰度大于０.５％的３２个属ꎬ其中已鉴定识别的属有２２个ꎮ在所有属中ꎬ平均相对丰度前１０且已鉴定到属的类群分别为假性阿利什霉属(Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａꎬ４.８１％~２０.６３％)㊁曲霉属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓꎬ２.３９％~１４.３１％)㊁顶孢霉属(Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍꎬ１.１６％~１１.０３％)㊁镰刀菌属(Ｆｕ￣ｓａｒｉｕｍꎬ１.１２％~８.３２％)㊁被孢霉属(Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａꎬ１.６４％~７.０６％)㊁腐质霉属(Ｈｕｍｉｃｏｌａꎬ１.１５％~５.４１)㊁毛壳菌属(Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍꎬ１.０８~３.８６％)㊁赤霉属(Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａꎬ０.７７％~４.８８％)㊁小囊菌属(Ｍｉ￣ｃｒｏａｓｃｕｓꎬ０.３４％~１１.１６％)㊁粘球菌属(Ｍｙｒｉｏｃｏｃ￣ｃｕｍꎬ０.４３％~
７.７９％)ꎮ
图２㊀
不同连作年限草莓根际土壤真菌门水平群落特征
图３㊀不同连作年限草莓根际土壤真菌
㊀㊀属水平群落结构特征
２.４.３㊀不同连作年限草莓根际主要真菌属丰度差异分析㊀相对丰度大于０.５％的真菌属中ꎬ久浩酵母属(Ｇｕｅｈｏｍｙｃｅｓ)㊁节丛孢属(Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ)㊁赤霉属㊁斗管囊霉属(Ｆｕｎｎｅｌｉｆｏｒｍｉｓ)㊁粘球菌属㊁腐质霉属㊁被孢霉属㊁镰刀菌属㊁顶孢霉属和曲霉属经过不同年限连作后相对丰度均发生显著变化ꎬ这些属集中隶属于子囊菌门㊁接合菌门和担子菌门ꎮ这１０个属的总丰度最高出现在连作第２年(３７.１１％)ꎬ最低出现在连作第４年(１７.６６％)ꎮ镰刀菌属ꎬ其相对丰度随连作年限的延长而显著增加ꎻ腐质霉属㊁赤霉属和久浩酵母属的相对丰度
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㊀第１２期㊀㊀㊀田春丽ꎬ等:不同连作年限温室草莓根际土壤性质及真菌群落特征分析
分别在连作第２㊁７㊁９年增加ꎻ而顶孢霉属㊁斗管囊霉属和节丛孢属的相对丰度则随连作年限的延长整体呈下降趋势ꎻ曲霉属最大相对丰度出现在连作第４年(１４.３１％)ꎬ之后逐渐下降ꎻ被孢霉属相对丰度最大和最小值分别出现在连作第１１年(７.０６％)和第４年(１.６４％)ꎻ草莓种植第１年粘球菌属的相对丰度(７.７９％)显著高于其他连作年限(图４)ꎮ
２.５㊀不同连作年限草莓根际土壤真菌群落差异及与土壤因子的相关性分析
２.５.１㊀草莓根际土壤因子与真菌属群落之间的相关性分析㊀为了研究属水平上土壤真菌群落组成与环境因素之间的相关性ꎬ构建了Ｓｐｅａｒｍａｎ相关性热图(图５)ꎮ可知ꎬ速效钾㊁ｐＨ值和速效氮与隐球菌属㊁镰刀菌属㊁小囊菌属㊁丝核菌属㊁赤霉属㊁腐质霉属和久浩酵母属呈负相关ꎮ有效磷和全氮分别与粘球菌属和被孢霉属呈负相关ꎬ有机质与明梭孢属(Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ)㊁假性阿利什霉属㊁被孢霉属㊁久浩酵母属㊁赤霉属㊁曲霉属和顶孢霉属呈负相关ꎮ此外ꎬｐＨ值与斗管囊霉属㊁粘球菌属和顶孢霉属呈正相关ꎬｐＨ值㊁速效钾㊁速效氮与斗管囊霉属和节丛孢属亦呈正相关
ꎮ
图４㊀
不同连作年限草莓根际真菌丰度差异分析
ＡＫ:速效钾ꎻｐＨ:ｐＨ值ꎻＡＮ:速效氮ꎻＡＰ:有效磷ꎻＴＮ:全氮ꎻＯＭ:有机质ꎮ
图５㊀基于真菌属丰度和环境变量间的Ｓｐｅａｒｍａｎ相关性热图
８０１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
２.５.２㊀草莓根际土壤因子与不同连作年限差异真菌属丰度间的ＲＤＡ分析㊀冗余分析(ＲＤＡ)表明ꎬ土壤环境因子在塑造微生物丰度方面发挥着重要作用(图６)ꎮ由ＲＤＡ分布结构可知ꎬＲＤＡ的前两个轴分别解释了总变异的３１.０６％(ＲＤＡ１)和２３.３２％(ＲＤＡ２)ꎮＣＫ㊁１年㊁２年与４㊁７㊁９㊁１１年之间在１０个主要真菌属存在差异ꎮ其中ｐＨ㊁速效氮㊁速效钾㊁有机质是决定４㊁７㊁９㊁１１ａ处理的斗管囊霉属㊁节丛孢属㊁久浩酵母属㊁腐质霉属㊁镰刀菌属丰度结构的主要土壤因子ꎻｐＨ㊁速效氮与斗管囊霉属㊁节丛孢属存在强烈的正相关关系ꎬ是决定两属相对丰度的主要土壤因素ꎮ有机质㊁速效钾㊁全氮是决定久浩酵母属㊁腐质霉属㊁镰刀菌属丰度结构的主要土壤因素
ꎮ
ＴＮ:全氮ꎻＡＮ:速效氮ꎻＯＭ:有机质ꎻＡＰ:有效磷ꎻＡＫ:速效钾ꎮ
图６㊀基于环境因子与主要真菌属
㊀㊀丰度间的ＲＤＡ分析
３㊀讨论与结论
土壤的理化性质会影响土壤微生物和动物的丰度及活性ꎬ从而直接或间接影响作物的产量与质量[１５]ꎮ本研究中ꎬ草莓根际ｐＨ值随种植年限的增加而呈降低趋势ꎬ与前人研究结果基本一致ꎬ
即当土壤ｐＨ超出一定合理范围草莓的生长会受到显著影响[１６]ꎬ当土壤ｐＨ低于６.５时ꎬ茶树的生长受到抑制[１７]ꎮ土壤酸化的一个原因可能是植物根系过量吸收了土壤中的Ｋ＋㊁Ｈ＋㊁铵根离子(ＮＨ４＋)等阳离子[１８]ꎮ本研究中ꎬ以ＮＨ４＋为主的速效氮和速效钾含量随种植年限的增加而降低ꎬ这与王海斌等[１７]的研究结论趋于一致ꎮ
不同连作年限根际土壤微生物群落结构和多样性对温室草莓可持续管理与生产至关重要ꎮ本研究中ꎬ子囊菌门㊁接合菌门和担子菌门是草莓根际土壤的优势真菌ꎬ其中子囊菌门(６４.３７％~
８７.０１％)是主要优势菌门ꎮ真菌在自然环境中扮演着分解者的角色ꎬ许多真菌存在于陆地㊁海洋和淡水栖息地[１９]ꎮ目前的分类系统中ꎬ大多数真菌主要归属于接合菌门㊁担子菌门和子囊菌门ꎬ以子囊菌门最多ꎬ因此子囊菌门更能反映土壤的健康状况[２０]ꎮ与未连作(ＣＫ)的土壤相比ꎬ连作草莓的根际土壤中Ｓｈａｎｎｏｎ㊁Ｃｈａｏ１㊁Ａｃｅ指数整体随连作年限的延长而增加ꎬ在连作第１１年达到最高ꎬＳｉｍｐｓｏｎ指数则相反ꎬ这意味着随着连作年限延长ꎬ真菌群落的丰富度和多样性随之增加ꎮ
本研究中ꎬ属水平上前１０优势属依次为假性阿利什霉属㊁曲霉属㊁顶孢霉属㊁镰刀菌属㊁被孢霉属㊁腐质霉属㊁毛壳菌属㊁赤霉属㊁小囊菌属和粘球菌属ꎬ与Ｎａｌｌａｎｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｕｌａ等[２１]在根际土壤真菌优势度研究中报道的基本相同ꎬ但各属相对丰度位次存在差异ꎮ这种差异可能是由于草莓连作年限或土壤本身的理化特性所致ꎮ进一步研究发现ꎬ在３２个属中ꎬ１０个属经过不同年限连作后相对丰度发生了显著变化ꎬ这些属的功能主要涉及土壤土传病害发生㊁系统防御和腐质分解ꎮ大多数土传病害是由土壤真菌引起的ꎬ如尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)㊁番茄棘壳孢菌(Ｐｙｒｅ￣ｎｏｃｈａｅｔａｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ)和黄萎病原菌(Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐｐ.)[１９ꎬ２２]ꎮ土传病害病原菌数量的增加会加剧连作障碍ꎬ其中镰刀菌属㊁久浩酵母属和腐质霉属的相对丰度随连作年限的延长整体显著增加ꎮ镰刀菌属含有多种致病菌种ꎬ镰刀菌丰度的增加可能导致植物病害发生ꎮ如层生镰刀病原菌(Ｆｕ￣ｓａｒｉｕｍｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ)㊁禾谷镰刀病原菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ)在作物生长过程中感染植物根系并产生霉菌毒素[２３]ꎮ久浩酵母属常被用于废品的降解ꎬ可以通过产生木质素酶和过氧化物酶降解含木质素的废弃物[２４]ꎮ腐质霉属可产生醋酸纤维素脱乙酰酶降解土壤中的生物质残体ꎬ增加土壤中木质素㊁纤维素和半纤维素含量[２５]ꎮ
本研究中ꎬ随着草莓连作年限的延长ꎬ斗管囊
霉属㊁顶孢霉属㊁节丛孢属的相对丰度显著下降ꎮ
９
０１㊀第１２期㊀㊀㊀田春丽ꎬ等:不同连作年限温室草莓根际土壤性质及真菌群落特征分析
斗管囊霉属包含许多丛枝菌根真菌(ＡＭＦ)ꎬＡＭＦ
是土壤中重要的功能菌群ꎬ对植物养分吸收㊁生长
发育㊁缓解环境胁迫及改善土壤特性等方面具有
积极作用[２６]ꎻ且ＡＭＦ可形成共同的菌丝网络ꎬ对养分㊁水分的转移以及植物群落的调节具有重要
作用[２７]ꎮ节丛孢属已被证明在接触的短时间内可杀死８５％的线虫[２８]ꎮ本研究中ꎬ连作后节丛孢属的丰度显著下降ꎬ意味着许多植物线虫种群可能会因此增加ꎮ内生菌顶孢霉属在植物病害防治中具有重要作用ꎮＰｅšａｋｏｖｉｃ'等[２９]研究表明ꎬ土壤肥力水平㊁微生物丰度与作物产量密切相关ꎮ因此镰刀菌属㊁久浩酵母属和腐质霉属丰度增加ꎬ而斗管囊霉属㊁顶孢霉属㊁节丛孢属丰度降低可能会导致土壤健康水平和草莓产量降低ꎮ
先前的研究表明土壤理化性质与微生物代谢
之间存在着密切关系[６ꎬ１８]ꎮ本研究中ꎬＳｐｅａｒｍａｎ相关性分析表明ꎬ速效钾㊁ｐＨ值和速效氮显著影响土壤真菌结构ꎮ此外ꎬ镰刀菌属㊁久浩酵母属㊁节丛孢属㊁斗管囊霉属与土壤理化性质密切相关ꎮ冗余分析(ＲＤＡ)分析表明ꎬｐＨ值㊁速效氮是决定斗管囊霉属㊁节丛孢属的主要土壤因子ꎻ速效钾是决定久浩酵母属㊁腐质霉属㊁镰刀菌属丰度结构的主要土壤因子ꎮ
综上ꎬ草莓根际土壤真菌多样性随连作年限
的增加而增加ꎬ具体而言ꎬ草莓连作后土传病害菌
镰刀菌属㊁腐质霉属㊁久浩酵母属丰度显著增加ꎬ
斗管囊霉属㊁节丛孢属丰度从连作第４年开始下
降ꎮ上述５个菌属可能是导致连作期间土壤性质
发生变化的关键菌群ꎮ连作４年后土壤养分含量
开始下降ꎻ土壤ｐＨ值㊁速效钾和速效氮为最重要
的土壤理化指标ꎬ可能是影响草莓连作系统中有
益菌群和致病菌群的关键因素ꎻｐＨ值㊁速效氮是
决定斗管囊霉属㊁节丛孢属的主要土壤因子ꎻ速效
钾是决定久浩酵母属㊁腐质霉属㊁镰刀菌属丰度的
主要土壤因子ꎮ
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㊀第１２期㊀㊀㊀田春丽ꎬ等:不同连作年限温室草莓根际土壤性质及真菌群落特征分析。