高分辨基因分型的临床详解演示文稿
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第12页，共42页。
AS的抗原学检测
【HLA-B27与强直性脊柱炎的临床分析】报道： HLA-B27抗原阳性率在AS患者高达96％以上，
而正常群体中仅4%-7%,HLA-B27抗原携带者发生
AS的相对危险率高达70%。
第13页，共42页。
与AS相关的B*27等位基因
第14页，共42页。
AS的基因学检测
幼年类风湿关节炎
（juvenile rheumatoid arthritis JRA)
急性前葡萄膜炎 (acute anterior uveitis，AAU) 白血病等疾病
第11页，共42页。
强直性脊柱炎（AS）
1973年Brewerton和schiosstein发现 强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis AS）与HLA-B27抗原有 非常强的相关,这是目前唯一有临床 价值的血型相关抗原,这在迄今已知 的HLA与疾病的关联中是最强和最典 型的。
易感性等位基因
B*2701,B*2702,B*2704,B*2705,B*27 10 B*2702, B*2704, B*2705, B*2713 B*2724 B*2709，B*2705 B*27XX B*2702 B*27XX B*27XX B*27XX B*27XX B*27XX B*27XX
凹槽的作用是结合抗原肽，使抗原肽与HLA-B27
分子牢固的结合。
第6页，共42页。
HLA-B*27等位基因结构及其特点
2002年WHO正式命名的HLA—B*27 等位基因达到了24个，其中只有15个 有相对应的抗原表达。到2009年11月 WHO正式命名HLA—B*27等位基因 达到59个(B*2701一B*2759) 。
基因占7.14%。
第23页，共42页。
HLA-B27与JRA致病机制的研究
以各种感染性微生物作为外来抗原（HLA-B27分子与其结构有相
似性），激活免疫细胞，通过损伤或分泌细胞因子触发异常的免疫反 应，引起自身组织的损害和变性。
特别是细菌、病毒的特殊成分作为超抗原，其结构与人类MHC抗原有 同源性，不需抗原呈递细胞加工处理，即可直接与T细胞受体 直接结合（HLA-B27充当细胞表面受体），激活T细胞。
生物结合，由此引起葡萄膜炎。 分子拟态假说:HLA—B27分子在结构上与激发
引起AAU的微生物肽序列相似,从而引发葡萄膜炎。
第27页，共42页。
其它疾病
【Genetic markers linked to rheumatoid arthritis are also strongly associated with articular manifestations in ulcerative colitis patients】
【Flt3一ITD mutations can generate leukaemia specific neoepitopes： potential role for immunotherapeutic approaches】 【Ankylosing spondylitis is linked to Klebsiella—the evidence】 等三篇文献报道：HLA-B27抗原与白塞氏病也有一 定的相关性。
聚合酶链反应-直接测序分型（PCR-SBT）
第34页，共42页。
PCR-SSP:针对HLA-B*27基因的外显子2的序列，
合成相应的HLA-B*27基因引物，在
PCR扩增仪上扩增即可，这种特异性 的PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电
泳检出，凝胶成像系统下观察结果。
第35页，共42页。
血清学检测HLA-B27抗原的优缺点
而B*27等位基因与AAU的关系报道较少。
【acute anterior uveitis and HLA-B27】报道，在HLA-B27 抗原阳性的AAU患者中,HLA-B*2704基因占44．7%, B*2705基因占
56%。
第26页，共42页。
HLA-B27与AAU致病机制的研究
葡萄膜炎-受体假说：HLA—B27(+)的AAU可能 由于HLA—B27分子担当细胞表面受体，其与微
第24页，共42页。
急性前葡萄膜炎（AAU)
急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis，AAU)是一
类常见的自身免疫性致盲眼病 ，病因复杂、病程长、易反
复发作,要确定其发病原因仍比较困难。自1973年 Brewerton DA等人首次报道HLA—B27抗原与AAU之间的
相关性以来，迄今为止，已发现2O多种眼病与HLA抗原具
性，且没有男女性别差异。
第22页，共42页。
【differential diagnosis juvenile ankylosing spondylitis and juvebile rheumatoid arthritis by subtypes of HLA-B27 alleles】报道：和该疾病相关 的HLA-B*27的等位基因涉及B*2705,B*2704, B*2707,B*2702基因。在HLA-B27抗原阳性的 JRA患者中，B*2705基因占60.7%，B*2704基 因占28.57%，B*2702基因占3.57%，B*2707
不同人群的AS患者涉及的B*27等位基因
第15页，共42页。
与AS相关的B*27等位基因
第16页，共42页。
不同人群AS患者的HLA-B*27等位基因频率
摘自【HLA—B*27高分辨等位基因在1 606例疑似强直性脊柱炎患者中的表达】
第17页，共42页。
HLA-B27与AS致病机制的研究
HLA-B27分子与非折叠蛋白理论假说 HLA-B27分子游离重链与AS
上的45位发生氨基酸的突变，这一改变直接影响
HLA-B27分子在细胞表面的表达，影响HLA-B27分 子与抗原肽的结合，同时影响了HLA-B27分子对胞 内外抗原的递呈。
第9页，共42页。
2.与HLA-B27相关的疾病
第10页，共42页。
强直性脊柱炎 （ankylosing spondylitis AS）
在争议。
第20页，共42页。
其它
HLA-B27可提高致关节炎的细菌在胞内的存活率，
从而加剧关节炎的严重度。
B27改变信号转导学说，即HLA-B27通过修饰
炎症因子基因相关的信号转导过程而致关节炎。
HLA-B39,HLA-B60可能对AS的诱发起到一定的作用。
第21页，共42页。
幼年类风湿性关节炎（JRA）
该认为是导致AS的发病原因之一。当HLA-B27分子适当的、正 确的组装时，其递呈的抗原肽通常被CD8 CTL识别；但当AS发
生时，限制性的CIM Th细胞却能识别非折叠、空载或缺失的B27分
子。在这种情况下，就是HLA II类分子递呈B27重链，降解后形 成的多肽被CD4 Th细胞识别后导致关节炎症。此研究目前还存
第28页，共42页。
此外，HLA-B27抗原与白血病、心脏疾病、鼻咽癌、银屑病、关节
炎型肠炎也有相关性，但相关报道较少 。
第29页，共42页。
名称
强直性脊柱炎
类风湿性关节炎 青少年自发性关节炎 脊椎关节炎 关节炎型炎症性肠病 白塞病 银屑病 白血病 银屑病 鼻咽癌 赖姆疏螺旋体病 HIV-1感染
量约为44×103U，包括胞外区，跨膜区，胞 内区三个结构域，其中胞外区又分为α1，α2， α3三个结构区；另一条为β链或轻链即β2微
球蛋白，分子量约12×103U，二者结合共同
组成HLA-B27抗原分子。
第4页，共42页。
HLA-B27抗原分子结构
第5页，共42页。
α 1区与α2区的肽链折叠后共同构成一个抗原 结合凹槽，槽内形成A,B,C,D,E,F共6个袋状结 构，其中B袋在HLA-B27分子中是最保守的结构。
第36页，共42页。
基因学方法检测HLA—B*27基因的优缺点（以
PCR-SSP为例）：
实验操作方面（1）只需PCR扩增仪和琼脂糖凝胶电泳设备；费用中等， 适合在我国现有条件下开展。
（2）标本需要量少，取材容易，提取的DNA可长期保存； 陈旧血、冷冻血也可用于DNA的提取，使留取标本不 受时间的限制。
高分辨基因分型的临床详解演 示文稿
第1页，共42页。
优选高分辨基因分型的临床
第2页，共42页。
1.HLA-B27抗原分子及其等位基因
第3页，共42页。
HLA-B27抗原分子结构及其特点
HLA-B27抗原分子是由位于人类第六号染色
体短臂上B*27等位基因编码的糖蛋白, 分子量
为56×103U。 由两条多肽链组成，一条为α链或重链，分子
实验操作方面（1）经典的血清学分型技术因其操作简便，准确率 尚可且成本较低，曾得到广泛应用。
（2）所用标本须为新鲜血液标本。 （3）受细胞纯度、补体差异、单抗效价的影响，
易出现错判漏判，观察结果存在主观因素 。 临床应用方面：血清学检测的是蛋白抗原，不能检测出HLA-B*27
等位基因，即血清学结果是阴性，只能说明HLAB27抗原阴性，并不能确定HLA-B*27基因是否存在。 目前尚无针对HLA-B*27不同等位基因的抗体，故不 能检测出对应的HLA-B*27等位基因.
其它
第18页，共42页。
HLA-B27分子非折叠蛋白理论假说
HLA I类分子是在内质网成熟的，新合成的HLA Iα进入内质网腔 与钙连蛋白结合，使I类分子在内质网中维持部分折叠，继而与新 合成的β2-微球蛋白组装成完整的I类分子，此时B27分子才能被认 为是成熟的，转运至细胞表面。研究发现，HLA-B27折叠速度较其他 HLA分子（非HLA-B27分子）慢。导致内质网腔中出现大量的折叠不 良或部分折叠的HLA-B27重链部分，通常情况下，非折叠的重链在内 质网腔内能够被清除，但由于一些相关物质的缺乏或无效，所致非折 叠的重链堆积，形成了非折叠蛋白反应。有资料报道，AS的发生可能 与这些HLA-B27分子的未折叠有关。
第19页，共42页。
HLA-B27分子游离重链与AS
HLA-B27分子的主要功能是：识别和处理抗原肽，然后在递 呈给T淋巴细胞。HLA-B27分子具有特殊的生物学效应，它在体外具
有形成重链二聚体的能力，主要是通过B27分子第67位氨基酸的残 基半氨酸的二硫键结合形成稳定的二聚体。通过认识HLA-B27 分子结构的特异性，重要的是深入研究游离重链的表达是否应
HLA—B*27等位基因呈多态性，主要 是因为个别的碱基突变造成的，编码蛋 白的差异主要集中在αl、α2结构区内。
第7页，共42页。
其中HLA-B*2701与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有2个氨基酸的不同；
其中HLA-B*2702与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有3个氨基酸的不同；
第30页，共42页。
3.HLA-B27的检测方法
第31页，共42页。
微量淋巴细胞毒实验（CDC） 流式细胞术（FCM） 分子生物学技术（PCR）
第32页，共42页。
三种检测方法的对比
第33页，共42页。
HLA-B27基因分型检测方法
特异性引物序列聚合酶链反应 (PCR-SSP) 序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-SSO）
其中HLA-B*2703与HLA-B*2705编码的蛋白 仅有1个氨基酸的差别，即在59位前者 为组氨酸（His），后者为酪氨酸（Tyr）；
第8页，共42页。
HLA-B*2705基因分布最广，几乎见于所有人种。
甚至认为其它等位基因都是由HLA-B*2705基因发
生突变、移位形成的。Leabharlann Baidu
HLA-B*2705编码的蛋白最为显著的特点就是在B袋
有相关性 ，其中最主要的是HLA—B27抗原与AAU之间的
相关性。
第25页，共42页。
【Association between HLA-B27 antigen and acute
anterior uveitis】指出：国内外报道有所不同，国内报道37.0％60％ AAU患者HLA-B27抗原呈阳性，国外报道19％-88％呈阳性,
幼年类风湿性关节炎（juvenile rheumatoid arthritis JRA)是类风湿性关节炎疾病中的一 个特殊类型，而HLA-B27抗原阳性的幼年类风 湿关节炎又是类风湿关节炎疾病中的一个亚 型。幼年类风湿性关节炎是儿童时期较常见 的结缔组织病，国外的报道发现，较多的幼 年类风湿性关节炎患者的HLA-B27抗原呈现阳
AS的抗原学检测
【HLA-B27与强直性脊柱炎的临床分析】报道： HLA-B27抗原阳性率在AS患者高达96％以上，
而正常群体中仅4%-7%,HLA-B27抗原携带者发生
AS的相对危险率高达70%。
第13页，共42页。
与AS相关的B*27等位基因
第14页，共42页。
AS的基因学检测
幼年类风湿关节炎
（juvenile rheumatoid arthritis JRA)
急性前葡萄膜炎 (acute anterior uveitis，AAU) 白血病等疾病
第11页，共42页。
强直性脊柱炎（AS）
1973年Brewerton和schiosstein发现 强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis AS）与HLA-B27抗原有 非常强的相关,这是目前唯一有临床 价值的血型相关抗原,这在迄今已知 的HLA与疾病的关联中是最强和最典 型的。
易感性等位基因
B*2701,B*2702,B*2704,B*2705,B*27 10 B*2702, B*2704, B*2705, B*2713 B*2724 B*2709，B*2705 B*27XX B*2702 B*27XX B*27XX B*27XX B*27XX B*27XX B*27XX
凹槽的作用是结合抗原肽，使抗原肽与HLA-B27
分子牢固的结合。
第6页，共42页。
HLA-B*27等位基因结构及其特点
2002年WHO正式命名的HLA—B*27 等位基因达到了24个，其中只有15个 有相对应的抗原表达。到2009年11月 WHO正式命名HLA—B*27等位基因 达到59个(B*2701一B*2759) 。
基因占7.14%。
第23页，共42页。
HLA-B27与JRA致病机制的研究
以各种感染性微生物作为外来抗原（HLA-B27分子与其结构有相
似性），激活免疫细胞，通过损伤或分泌细胞因子触发异常的免疫反 应，引起自身组织的损害和变性。
特别是细菌、病毒的特殊成分作为超抗原，其结构与人类MHC抗原有 同源性，不需抗原呈递细胞加工处理，即可直接与T细胞受体 直接结合（HLA-B27充当细胞表面受体），激活T细胞。
生物结合，由此引起葡萄膜炎。 分子拟态假说:HLA—B27分子在结构上与激发
引起AAU的微生物肽序列相似,从而引发葡萄膜炎。
第27页，共42页。
其它疾病
【Genetic markers linked to rheumatoid arthritis are also strongly associated with articular manifestations in ulcerative colitis patients】
【Flt3一ITD mutations can generate leukaemia specific neoepitopes： potential role for immunotherapeutic approaches】 【Ankylosing spondylitis is linked to Klebsiella—the evidence】 等三篇文献报道：HLA-B27抗原与白塞氏病也有一 定的相关性。
聚合酶链反应-直接测序分型（PCR-SBT）
第34页，共42页。
PCR-SSP:针对HLA-B*27基因的外显子2的序列，
合成相应的HLA-B*27基因引物，在
PCR扩增仪上扩增即可，这种特异性 的PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电
泳检出，凝胶成像系统下观察结果。
第35页，共42页。
血清学检测HLA-B27抗原的优缺点
而B*27等位基因与AAU的关系报道较少。
【acute anterior uveitis and HLA-B27】报道，在HLA-B27 抗原阳性的AAU患者中,HLA-B*2704基因占44．7%, B*2705基因占
56%。
第26页，共42页。
HLA-B27与AAU致病机制的研究
葡萄膜炎-受体假说：HLA—B27(+)的AAU可能 由于HLA—B27分子担当细胞表面受体，其与微
第24页，共42页。
急性前葡萄膜炎（AAU)
急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis，AAU)是一
类常见的自身免疫性致盲眼病 ，病因复杂、病程长、易反
复发作,要确定其发病原因仍比较困难。自1973年 Brewerton DA等人首次报道HLA—B27抗原与AAU之间的
相关性以来，迄今为止，已发现2O多种眼病与HLA抗原具
性，且没有男女性别差异。
第22页，共42页。
【differential diagnosis juvenile ankylosing spondylitis and juvebile rheumatoid arthritis by subtypes of HLA-B27 alleles】报道：和该疾病相关 的HLA-B*27的等位基因涉及B*2705,B*2704, B*2707,B*2702基因。在HLA-B27抗原阳性的 JRA患者中，B*2705基因占60.7%，B*2704基 因占28.57%，B*2702基因占3.57%，B*2707
不同人群的AS患者涉及的B*27等位基因
第15页，共42页。
与AS相关的B*27等位基因
第16页，共42页。
不同人群AS患者的HLA-B*27等位基因频率
摘自【HLA—B*27高分辨等位基因在1 606例疑似强直性脊柱炎患者中的表达】
第17页，共42页。
HLA-B27与AS致病机制的研究
HLA-B27分子与非折叠蛋白理论假说 HLA-B27分子游离重链与AS
上的45位发生氨基酸的突变，这一改变直接影响
HLA-B27分子在细胞表面的表达，影响HLA-B27分 子与抗原肽的结合，同时影响了HLA-B27分子对胞 内外抗原的递呈。
第9页，共42页。
2.与HLA-B27相关的疾病
第10页，共42页。
强直性脊柱炎 （ankylosing spondylitis AS）
在争议。
第20页，共42页。
其它
HLA-B27可提高致关节炎的细菌在胞内的存活率，
从而加剧关节炎的严重度。
B27改变信号转导学说，即HLA-B27通过修饰
炎症因子基因相关的信号转导过程而致关节炎。
HLA-B39,HLA-B60可能对AS的诱发起到一定的作用。
第21页，共42页。
幼年类风湿性关节炎（JRA）
该认为是导致AS的发病原因之一。当HLA-B27分子适当的、正 确的组装时，其递呈的抗原肽通常被CD8 CTL识别；但当AS发
生时，限制性的CIM Th细胞却能识别非折叠、空载或缺失的B27分
子。在这种情况下，就是HLA II类分子递呈B27重链，降解后形 成的多肽被CD4 Th细胞识别后导致关节炎症。此研究目前还存
第28页，共42页。
此外，HLA-B27抗原与白血病、心脏疾病、鼻咽癌、银屑病、关节
炎型肠炎也有相关性，但相关报道较少 。
第29页，共42页。
名称
强直性脊柱炎
类风湿性关节炎 青少年自发性关节炎 脊椎关节炎 关节炎型炎症性肠病 白塞病 银屑病 白血病 银屑病 鼻咽癌 赖姆疏螺旋体病 HIV-1感染
量约为44×103U，包括胞外区，跨膜区，胞 内区三个结构域，其中胞外区又分为α1，α2， α3三个结构区；另一条为β链或轻链即β2微
球蛋白，分子量约12×103U，二者结合共同
组成HLA-B27抗原分子。
第4页，共42页。
HLA-B27抗原分子结构
第5页，共42页。
α 1区与α2区的肽链折叠后共同构成一个抗原 结合凹槽，槽内形成A,B,C,D,E,F共6个袋状结 构，其中B袋在HLA-B27分子中是最保守的结构。
第36页，共42页。
基因学方法检测HLA—B*27基因的优缺点（以
PCR-SSP为例）：
实验操作方面（1）只需PCR扩增仪和琼脂糖凝胶电泳设备；费用中等， 适合在我国现有条件下开展。
（2）标本需要量少，取材容易，提取的DNA可长期保存； 陈旧血、冷冻血也可用于DNA的提取，使留取标本不 受时间的限制。
高分辨基因分型的临床详解演 示文稿
第1页，共42页。
优选高分辨基因分型的临床
第2页，共42页。
1.HLA-B27抗原分子及其等位基因
第3页，共42页。
HLA-B27抗原分子结构及其特点
HLA-B27抗原分子是由位于人类第六号染色
体短臂上B*27等位基因编码的糖蛋白, 分子量
为56×103U。 由两条多肽链组成，一条为α链或重链，分子
实验操作方面（1）经典的血清学分型技术因其操作简便，准确率 尚可且成本较低，曾得到广泛应用。
（2）所用标本须为新鲜血液标本。 （3）受细胞纯度、补体差异、单抗效价的影响，
易出现错判漏判，观察结果存在主观因素 。 临床应用方面：血清学检测的是蛋白抗原，不能检测出HLA-B*27
等位基因，即血清学结果是阴性，只能说明HLAB27抗原阴性，并不能确定HLA-B*27基因是否存在。 目前尚无针对HLA-B*27不同等位基因的抗体，故不 能检测出对应的HLA-B*27等位基因.
其它
第18页，共42页。
HLA-B27分子非折叠蛋白理论假说
HLA I类分子是在内质网成熟的，新合成的HLA Iα进入内质网腔 与钙连蛋白结合，使I类分子在内质网中维持部分折叠，继而与新 合成的β2-微球蛋白组装成完整的I类分子，此时B27分子才能被认 为是成熟的，转运至细胞表面。研究发现，HLA-B27折叠速度较其他 HLA分子（非HLA-B27分子）慢。导致内质网腔中出现大量的折叠不 良或部分折叠的HLA-B27重链部分，通常情况下，非折叠的重链在内 质网腔内能够被清除，但由于一些相关物质的缺乏或无效，所致非折 叠的重链堆积，形成了非折叠蛋白反应。有资料报道，AS的发生可能 与这些HLA-B27分子的未折叠有关。
第19页，共42页。
HLA-B27分子游离重链与AS
HLA-B27分子的主要功能是：识别和处理抗原肽，然后在递 呈给T淋巴细胞。HLA-B27分子具有特殊的生物学效应，它在体外具
有形成重链二聚体的能力，主要是通过B27分子第67位氨基酸的残 基半氨酸的二硫键结合形成稳定的二聚体。通过认识HLA-B27 分子结构的特异性，重要的是深入研究游离重链的表达是否应
HLA—B*27等位基因呈多态性，主要 是因为个别的碱基突变造成的，编码蛋 白的差异主要集中在αl、α2结构区内。
第7页，共42页。
其中HLA-B*2701与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有2个氨基酸的不同；
其中HLA-B*2702与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有3个氨基酸的不同；
第30页，共42页。
3.HLA-B27的检测方法
第31页，共42页。
微量淋巴细胞毒实验（CDC） 流式细胞术（FCM） 分子生物学技术（PCR）
第32页，共42页。
三种检测方法的对比
第33页，共42页。
HLA-B27基因分型检测方法
特异性引物序列聚合酶链反应 (PCR-SSP) 序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-SSO）
其中HLA-B*2703与HLA-B*2705编码的蛋白 仅有1个氨基酸的差别，即在59位前者 为组氨酸（His），后者为酪氨酸（Tyr）；
第8页，共42页。
HLA-B*2705基因分布最广，几乎见于所有人种。
甚至认为其它等位基因都是由HLA-B*2705基因发
生突变、移位形成的。Leabharlann Baidu
HLA-B*2705编码的蛋白最为显著的特点就是在B袋
有相关性 ，其中最主要的是HLA—B27抗原与AAU之间的
相关性。
第25页，共42页。
【Association between HLA-B27 antigen and acute
anterior uveitis】指出：国内外报道有所不同，国内报道37.0％60％ AAU患者HLA-B27抗原呈阳性，国外报道19％-88％呈阳性,
幼年类风湿性关节炎（juvenile rheumatoid arthritis JRA)是类风湿性关节炎疾病中的一 个特殊类型，而HLA-B27抗原阳性的幼年类风 湿关节炎又是类风湿关节炎疾病中的一个亚 型。幼年类风湿性关节炎是儿童时期较常见 的结缔组织病，国外的报道发现，较多的幼 年类风湿性关节炎患者的HLA-B27抗原呈现阳