(完整版)生物工程复习资料(缩)

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1 .1生物工程的产生及定义

.生物工程的定义：人们以现代生命科学为基础,结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的，即现代生物工程技术。

1。2 生物工程的种类

.基因工程

。细胞工程

.发酵工程

.酶工程

.蛋白质工程

应用：农业、环境、食品、医药等多个方面基因工程

。基因工程(gene engineering）是指在基因水平上的操作井改变生物遗传特性的技术.

细胞工程

.细胞工程(cellengineering）是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质的技术。细胞工程主要包括动植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术（也称细胞杂交技术）、细胞器移植技术等。

发酵工程

发酵工程(fermentationengineering)是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能,通过现代工程技术手段（主要是发酵罐或生物反应器的自动化、高效化、功能多样化、大型化）生产各种特定的有用物质;或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。由于发酵多与微生物密切联系在一起,所以又有微生物工程或微生物发酵工程之称。。

酶工程

。利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能以及对酶进行的修饰改造,并借助于生物反应器生产人类所需产品的一项技术。

.主要包括酶的固定化技术、细胞固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计技术等。

蛋白质工程

蛋白质工程(protein engineering）这一名称是1981年由美国基因公司的Ulmer提出的,它是指在基因工程的基础上，结合蛋白质晶体学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段,对蛋白质进行修饰、改造、拼接，以产生能满足人类需要的新型蛋白质的技术。生物工程发展的趋势

.目前三个平台:DNA重组、细胞培养和DNA芯片

.未来将会形成的几个新的平台

1.基因组平台

2.生物芯片

3。干细胞生物学

4。生物信息学

基因工程gene engineering

。运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。

基因工程的基本过程就是利用重组DNA （recombinant DNA）技术,在体外通过人工“剪切（cut）”和“拼接（splice)”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产生出人类需要的基因。

基因工程是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因)分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。

基因工程研究的理论依据①不同的基因有相同的物质基础

②基因是可切割的

③基因是可转移的

④多肽与基因之间存在对应关系

⑤遗传密码是通用的

⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一

代

基因工程技术路线

1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备)

——切

2、DNA片段和载体的连接——重组体DNA—

—接

3、外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆

和基因文库-—-—-——转

4、选择基因（目的基因）—-————-—选

5、目的基因表达--—----表达

1.1基因工程的工具酶

限制性核酸内切酶——-—-——-—基因的

剪刀

DNA聚合酶———-----—-基因的针线

DNA连接酶

限制性核酸内切酶

。一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷

酸序列的内切核酸酶。

.restriction endonuclease

.这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。

.根据酶的功能、大小和反应条件，及切割Ｄ

ＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类:

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶

。Ⅰ型酶不适合做基因工程的工具酶

。Ⅲ型酶在基因工程中也不常用

.Ⅱ型酶是基因工程理想的工具酶

Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性

1、识别序列和切割位点

2、切割方式

3、同尾酶和同裂酶

4、限制性片段长度：经限制性核酸内切酶切

割后产生的DNA片段。

切割频率：某限制酶在该DNA切割位点出现

频率

1、识别序列

.可识别长度为4—7bp的双链DNA特定序列，

该识别序列（识别位点）常呈旋转对称性。

1、切割位点

.切割位点与其识别序列一致，在其识别序列

内切割DNA。

2、切割方式

3、同尾酶和同裂酶

。指来源不同、识别序列不同但产生相同的

粘性末端的核酸内切酶。

。同裂酶指来源不同、而识别序列和切割方

式均相同的核酸内切酶。

DNA连接酶

.能够将两端DNA拼接起来的酶类

.原核生物主要有两种类型的DNA连接

酶:E．coli DNA连接酶和T4DNA 连接酶。

。最常见的是T4噬菌体DNA连接酶

.DNA连接酶能够催化DNA链上彼此相邻的3’

—羟基(OH ）和5'—磷酸基团（—P），形成

磷酸二酯键。

.DNA连接酶就可以用来在体外连接DNA片段

.DNA连接酶的作用

.是将双螺旋DNA分子的某一条链上两个相邻

核苷酸之失去一个磷酸二酯键所出现的单链

缺口封闭起来，即催化3'-OH和5'-p之间形

成磷酸二酯键,从而将具黏性末端的双链

DNA、平末端双链DNA以及带缺口的双链DNA

连接起来。

原核生物主要有两种类型的DNA连接酶

。E．coli DNA连接酶

.T4DNA 连接酶

。催化反应能量来源不同

。T4DNA连接酶用ATP，而E．coliDNA连接

酶则用NAD

。催化平末端连接的能力不同

.只有T4DNA连接酶能够连接两条平末端的双

螺旋的DNA片段

DNA聚合酶

催化DNA体外合成反应

（一）常用的DNA聚合酶：

。大肠杆菌DNA聚合酶

.大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片断酶

。T4噬菌体DNA聚合酶

。T7噬菌体DNA聚合酶

。Taq DNA聚合酶

DNA聚合酶I（DNasel）是一种

单链多肽蛋白质，具有三种不同的酶催活性,

即5'→3’的聚合酶活性、5'→3’的核酸外

切酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。

主要用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸

分子杂交用的带放射性标记的DNA探针

Klenow酶的主要用途

.①修补经限制性内切酶消化或其他方法所

形成的5’或3'突出末端,制备平末端.

。②对具有3’隐蔽末端的DNA片段作放射性

末端标记。

。③cDNA克隆中的第二链cDNA的合成。

。④DNA序列测定。

T4DNA聚合酶

.这是由T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物纯

化而来,具有两种酶催活性,即5’→3’的聚

合酶活性和3'→5’的核酸外切酶活性。

主要用途

。①可将任何形式的双链DNA制备成平末端

的双链DNA。

。外切酶的活性比Klenow酶强200倍，并且

在高浓度的dNTP存在时，降解作用即会停止

。②进行双链DNA的3'末端标记。

T7DNA聚合酶

.具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5'的核

酸外切酶活性

。主要用途：

。①用于拷贝大分子量模板的引物延伸反应;

.②如同DNA聚合酶一样,可通过单纯的延伸

或取代合成的途径，标记DNA的3’末端，也

可用来将双链DNA的5’或3'突出端转变成

平末端的结构。

修饰的T7DNA聚合酶

.对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全

失去3’→5’的核酸外切酶活性

。修饰的T7DNA聚合酶的加工能力以及在单

链模板上的聚合作用的速率增加了3—9倍

。测序时常用此酶，故亦称测序酶

TaqDNA聚合酶

。最适的活性温度是72℃,连续保温30min仍

具有相当的活性

。在补加有四种脱氧核苷三磷酸的反应体系

中,能以高温变性的靶DNA分离出来的单链

DNA为模板，按5' →3’的方向合成新生的

互补链DNA.

(二)分子克隆中常用的其他工具酶

。甲基化酶

。末端转移酶

。碱性磷酸酶

。逆转录酶

.S1核酸酶

.Bal31植酸酶

1。2基因工程的载体

.Vector，本质是DNA

。携带外源基因进入到受体细胞的运载工具

载体的功能：

.运送外源基因高效转入受体细胞

。为外源基因提供复制能力或整合能力

。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

基因克隆载体具备条件

.在克隆载体合适的位置含有允许外源DNA片

段组入的克隆位点，并且这样的克隆位点应

尽可能的

多。

。克隆载体能携带外源DNA片段进入受体细

胞，或停留在细胞质中进行自我复制；或整

合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，

随这些DNA同步复制。

基因克隆载体具备条件

。具有能够直接观察的表型特征

。克隆载体必须是安全的.

.易于从宿主细胞中分离，并进行纯化.

2基因克隆载体分类

根据导入的受体生物。可以分为:

.大肠杆菌载体

.植物载体

.酵母载体

。动物载体

将外源DNA导入原核生物细胞→大肠杆菌载

体

。质粒载体

。噬菌体载体

。柯斯质粒载体