HPLC测定天麻素的含量和有关物质

第35 卷第4 期西南民族大学学报·自然科学版Jun. 2009 Journal of Southwest University for Nationalities⋅Natural Science Edition
文章编号: 1003-2843(2009)04-0781-04
HPLC 测定天麻素的含量和有关物质
李婧
(西南民族大学化学与环境保护工程学院, 四川成都610041)
摘要: 目的建立测定天麻素原料药中天麻素的含量及有关物质的高效液相色谱法. 方法采用Hypersil C18 色谱柱, 甲醇-0.01moL·L-1 磷酸二氢钠(8:92, 磷酸调节pH 至 4.0±0.1)为流动相, 检测波长为220nm, 流速 1.0 mL·min-1. 结果天麻素在 2.5～40.0 μg·mL-1 范围内, 峰面积与其浓度线性关系良好(r＝0.9999), 高、中、低 3 种浓度的平均加样回收率为99.7％～100.3%, RSD 为0.44％～0.82% , 有关物质的限量为 1.0%. 结论本法准确、简便、快速, 适用于天麻素原料药的质量控制.
关键词: 天麻素; 含量测定; 有关物质; 高效液相色谱法
中图分类号: R284.1 文献标识码: A
天麻素(Gastrodin, C13H18O7)化学名为4一羟甲基苯一B—D一吡喃葡萄糖苷, 是名贵药材天麻的有效单体, 主要用于治疗神经衰弱、神经衰弱综合征及血管神经性头痛等症, 亦可治疗脑外伤性综合征、眩晕症如美尼尔病、药性眩晕、外伤性眩晕等[1]. 目前国内外学者对该药的药理作用、不同制剂的质量控制等方面进行了较深入的研究[2, 6]. 本文建立了天麻素原料药含量测定及有关物质检查的RP-HPLC法, 该法简便、快速、准确, 适用于天麻素的质量控制.
1 仪器与试药
日本岛津LC-10A 高效液相色谱仪, SPD-10Avp 型紫外检测器, Sage DataSystem 色谱工作站; 天麻素原料药由浙江诚意药业有限公司提供(批号：2005-0902, 2004-0409, 2005-0906); 天麻素对照品(供含量测定用)由中国药品生物制品检定所提色供(批号：807-200304); 水为重蒸馏水; 甲醇为色谱醇; 其它试剂均为分析纯.
2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱为Hypersil C18 柱(250 mm×4.6 mm, 10 μm); 流动相为甲醇-0.01 moL·L-1 磷酸二氢钠(8:92, 磷酸调节pH 至4.0±0.1); 流速为1.0 mL·min-1; 检测波长为220 nm; 柱温为30℃. 理论板数按天麻素峰计算应不低于3000.
3 含量测定
3.1 测定法精密称取本品适量, 加流动相制成每1mL 中含10 μg 的溶液, 作为供试品溶液; 另取天麻素对照品适量, 加流动相制成每1 mL 中含10 μg 的溶液, 作为对照品溶液; 取供试品和对照品溶液各20 μL 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算天麻素的含量.
收稿日期：2009-04-07
作者简介：李婧(1985-), 女, 西南民族大学化学与环境保护工程学院助理实验师.
782 西南民族大学学报·自然科学版第35 卷3.2 分析方法验证
3.2.1 专属性考察“3.1 项下”的供试品溶液、对照品溶液及空白流动相色谱图见图1. 流动相在天麻素峰处无干扰, 天麻素峰与相邻杂质峰的分离度符合要求.
图1 天麻素HPLC 测定色谱图
fig1 Chromatograms of Gastrodin
A 样品溶液(sammple solution);
B 对照品溶液(reference substance solution);
C 空白流动相(mobile phase)
1 天麻素(Gastrodin)
3.2.2 线性关系及线性范围精密称取天麻素对照品适量, 用流动相制成每1mL 中含2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 μg 的溶液, 分别精密吸取20 μL 注入色谱仪, 记录色谱图. 以天麻素峰面积Y 对浓度X 进行线性回归, 回归方程为：Y=18702x+583.45, r = 0.9999 (n=6), 天麻素浓度与峰面积在2.5～40.0 μg·mL-1 范围内线性关系良好.
3.2.3 精密度试验精密称取天麻素对照品适量, 用流动相制成含天麻素5.0、10.0、30.0 μg·mL-1 的溶液, 分别精密吸取20 μL 注入色谱仪, 重复进样5 次. 各浓度峰面积的RSD 分别为1.1%、0.35%、0.63%(n=5), 方法的进样精密度良好.
3.2.4 重复性试验取同一批样品(批号：2005-0902), 按3.1 项下平行制备6 份, 测得平均含量为99.5%, RSD 为 1.05% (n=6), 方法的重复性良好.
3.2.5 回收试验在已知含量(约10 μg·mL-1)供试品溶液中, 分别加入一定量的天麻素对照品, 配成高、中、低3 种浓度溶液(18.1、20.4、22.2 μg·mL-1), 按3.1 项下试验, 测得平均回收率分别为99.7％、100.1％及100.3 ％, RSD 分别为0.44％、0.46％及0.82％(n＝3).
3.2.6 供试品溶液稳定性考察按3.1 项下制备供试品溶液(批号：2005-0902), 置室温下于不同时间(1、2、3、
4、6、8h)分别进样20 μL, 峰面积的RSD 为0.82%, 供试品溶液在8 小时内基本稳定.
3.3 样品含量测定照3.1 项下方法对取3 批天麻素样品进行测定. 结果见表 1.
4 有关物质检查
4.1 测定法精密称取本品适量, 加流动相制成每1mL 中含0.5 mg 的溶液, 作为供试品溶液; 精密量取1 mL, 置100 mL 量瓶中, 加流动相稀释至刻度, 摇匀, 作为对照溶液. 取对照溶液20 μL 注入色谱仪, 调节检测灵敏度, 使主成分峰高约为记录仪满量程的20-25％; 再取供试品溶液20 μL 注入色谱仪, 记录色谱图至主成分峰保留时间的 2 倍. 供试品溶液色谱图中各杂质峰面积总和不得大于对照溶液的主峰面积(1.0%).
4.2 分析方法验证
第4 期
4.2.1 专属性考察为了考察该法能否有效检测出本品在生产及贮存过程中可能产生的降解产物, 根据药物结构特点及贮存条件, 进行以下破坏性试验.
酸解试验：取本品5 mg, 加4mL 0.1 mol·L-1 盐酸, 室温放置2h 后, 用0.1 mol·L-1 氢氧化钠中和至中性, 加流动相至10 mL, 照 4.1 项下试验, 在 5.408、5.833、12.592 min 处出现多个杂质峰, 与主成分能达到基线分离.
碱解试验：取本品5 mg, 加4mL 0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶解, 室温放置2 小时, 用稀盐酸中和至中性, 加流动相至10 mL, 照 4.1 项下试验, 在.833、5.425min 有杂质峰, 它们均与主成分能达到基线分离.
高温试验：取本品 5 mg, 在60︒C 下放置10 天, 照 4.1 项下试验, 在12.658 min 有杂质峰, 与主成分能达到基线分离.
强光照射试验：取本品5 mg, 在强光(照射度为4500±500LX)下照射10 天. 照 4.1 项下试验. 在4.133、13.117 min 时出现杂质峰, 与主成分能达到基线分离.
高湿度试验取本品5 mg, 在湿度为95%的环境下放置10 天, 照4.1 项下试验, 在5.0、6.8 min 处出现杂质峰, 与主成分能达到基线分离.
该法能有效检测出各破坏性试验产生的降解物, 且降解产物峰均能与主成分峰达到基线分离, 所建方法的专属性较好.
4.2.2 检测限精密称取天麻素对照品适量, 用流动相制成每1mL 中含1.0 μg 的溶液, 精密吸取5 μL 注入液相色谱仪, 此时信噪比约等于3, 检测限为5 ng.
4.2.3 对照溶液进样精密度按4.1 项下平行制备每1mL 中含5 μg 的对照溶液5 份, 分别进样20 μL, 以对照溶液主峰面积进行进样精密度考察, 结果RSD 为0.65％.
4.2.4 重复性试验精密称取本品适量, 按4.1 项下平行制备每1ml 中含0.5 mg 的供试品溶液6 份, 分别进样20 μL, 以杂质含量进行方法的精密度考察, 结果RSD 为3.06％.
4.3 有关物质测定结果用4.1 项下方法, 对3 批样品进行有关物质检查, 结果见表1.
批号(Lot No.)
表1 3 批样品测定结果(n＝3)
Tab 1 results of 3 batches(n＝3)
含量％
(content)
有关物质％
(related substances)
2004-0409 99.36 0.09
2005-0902 100.5 0.08
2005-0906 100.1 0.08
5 讨论
精密称取天麻素对照品适量, 用流动相制成每1ml 中含天麻素10 mg 的溶液, 进行紫外扫描(200～400nm), 在220±1nm 及268±1nm 波长处有最大吸收, 其中在220±1nm 处吸收较强, 通过HPLC 分析发现, 220nm 波长处能检测的杂质峰个数较多, 杂质峰面积最大, 且主峰也有较强吸收, 因此采用220nm 作为本品有关物质测定波长.
笔者对流动相进行不同比例、盐浓度和pH 值进行考察, 当流动相为[甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢钠(8:92, 磷酸调节pH 至 4.0±0.1)]时, 主峰保留时间合适, 柱效较高, 主峰与相邻杂质峰分离度符合要求, 且能检查到较多的杂质峰. 因此, 最终确定：以甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢钠(8:92, 磷酸调节pH 至4.0±0.1)为本品有关物质检查及含量测定的流动相.
784 西南民族大学学报·自然科学版第35 卷
参考文献：
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Determination of Gastrodin and related substances in Gastrodin by HPLC
LI Jing
(School of Chemistry & Environmental Protection Engineering, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)
Abstract: Objective: To establish an RP-HPLC for determination of Gastrodin and related substances in Gastrodin. Method: Gastrodin and related substances are determinated on HPLC instrument fixed with a Hypersil C18 column (250mm×4.6mm,10 μm) with UV detection at 220nm, and the mobile phase consists of phosphoric buffer( 0.01moL·L-1 NaH2PO4) and methyl alcohol (98:2, adjusted to pH4.0±0.1 with phosphoric acid), the flow rate is 1.0 ml·min-1. Result: The calibration curve is linear (r = 0.9999) within the range of 2.5～40.0 g·mL-1 for Gastrodin, the average recovery rate is from 99.7% to 100.3% for three different levels of the amount of Gastrodin, RSD is from 0.44% to 0.82%. The limit of related substances is 1.0%. Conclusion: This method is simple, quick, accurate and effective for testing related compounds in Gastrodin and for its contents
determination. This method is suitable for the quality control for Gastrodin.
Key words: Gastrodin; related substance; content determination; H PLC。