16SrDNA 实验原理

一、实验原理
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。

16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。

5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。

而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：
PCR实验原理
即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

二、主要器具及试剂
PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）
三、操作方法
1. 细菌基因组总DNA的提取
接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。

(1)菌体收集：取1.5 mL新鲜的菌液于EP管中，12000 r/min离心30 s，弃净上清，收集菌体。

(2)辅助裂解：加100 μg/mL溶菌酶50 μL，37 ℃处理30min。

(3)裂解：向每管加入200 mL预冷的SDS裂解缓冲液，用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。

(4)向每管加入66 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀后，12000 r/min离心10 min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。

(5)将上清转移到新EP管中，加入等体积的Tris-饱和酚，充分混匀，12000 r/min离心3 min，进一步沉淀蛋白质。

(6)取离心后的水层，加等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），充分混匀后，12000 r/min离心3 min，去除苯酚。

(7)小心取上清，用预冷2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，13000 r/min离心15 min，弃上清。

(8)用400 μL75%的乙醇洗涤沉淀2次。

(9)室温干燥后，用40 μL 1×TE溶解DNA。

(10)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

(11)提取的基因组总DNA-40 ℃冰箱保存备用。

2. PCR扩增细菌的16S rDNA
(1)16S rDNA的PCR引物：采用细菌的通用引物27F和1492R
(2)PCR反应体系为（20μL）：灭菌蒸馏水8.9 μL，
10×buffer 2 μL，
10 mmol/L dNTP 0.4 μL，
27F和1492R引物各 4 μL，
DNA模板0.5 μL，
Taq polymerase 0.2 μL。

(3)PCR反应条件：
93 ℃预变性5 min、94 ℃变性18 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸78 s，循环30次，72 ℃延伸7 min。

(4)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

3. PCR扩增目的片断的纯化
通过PCR扩增出大量的目的片段，经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切下含有目的条带的胶块装入1.5 mL的EP管中，用B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收DNA，操作按说明书进行，方法如下：
(1)加入700 μL溶胶液，55 ℃水浴溶胶，其间偶尔摇动，直至胶块全部溶解。

(2)将溶胶液转移至吸附柱中，12000 r/min离心30 s，重复一次，提高回收率。

(3)向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12000 r/min离心30 s，倒掉废液，重复漂洗一次。

12000 r/min离心2 min以完全去除漂洗液。

(4)将吸附柱移至一个干净的1.5 mLEP管中，向吸附柱膜中央加入40 μL的洗脱缓冲液，12000 r/min离心2 min收集DNA。

(5)回收DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

4. 16S rDNA目的片断的克隆
PCR纯化产物与pMD18-T载体连接体系（10 μL）：胶回收产物2 μL，pMD18-T载体1 μL，SoulutionⅠ5 μL，无菌去离子水2 μL，16 ℃连接4 h。

转化E. coli JM109
(1)取50 μL E. coli JM109感受态细胞于冰中融化。

(2)将5 μL连接产物加入到已融化的感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰浴30 min。

(3)42 ℃保温90 s。

(4)冰浴2~3 min。

(5)加入450 μL LB液体培养基，轻轻混匀，200 r/min，37 ℃培养40 min。

(6)取适量上述培养液均匀涂布在Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上，37 ℃培养过夜。

5. 转化子的筛选和鉴定
（1）重组菌株的菌落PCR
通过蓝白斑筛选阳性转化子，用灭菌的枪头将白色菌落接种至4 mL LB液体培养基中，200 r/min，37 ℃培养4 h。

取菌液作为PCR模板。

PCR反应体系（20 μL）：灭菌蒸馏水7.4 μL，10×PCR buffer（含15 mmol/L MgCl2）2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，2.5 μmol/L的上游和下游引物各4 μL，菌液2 μL，5 U/μL Taq polymerase0.2 μL。

PCR反应条件：93 ℃预变性5 min、94 ℃变性18 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸78 s，循环30次，72 ℃延伸7 min。

1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

（2）重组质粒的核苷酸序列的测定
对经过鉴定含有目的片断的单克隆菌液加入甘油-40 ℃保存，同时将同一单克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，将测得的序列提交GenBank数据库，根据测序结果，用BLAST搜索软件在NCBI （/）的GenBank数据库中调出相似性较高的16S rDNA基因序列，用ClustalX 1.81软件进行多序列比对，用Phylipwx软件包中的Seqboot，Dnapars和Consense进行同源性分析并构建系统发育树。

四、实验结果提交
鉴定菌株的序列与哪个种最匹配，并构建该菌株的系统进化树。