常见的生化与分子生物学技术PPT课件
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电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将 其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电 泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸 电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳， 以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为 支持物的凝胶电泳。
等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、 二维电泳、脉冲场凝胶电泳。
等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各组分的区带 相随并形成清晰的界面，并以等速移动。
等电聚焦：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形 成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区 带，且分辨率较高。（表面看与区带电泳相似，但原理不同）
DNA的琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子 质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。
盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子 多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀 法；酸碱变性沉淀法等 。
吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶 吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。
超过滤法：把提取液装入过滤装置， 在空气或氮气的压力下，使小分子物 质通过半透膜，大分子物质留在膜内。
• 膜分离与常规膜的分分离离技基术相本比技术
– 具有无相变化、能耗低、过程简单、不污染环境等优 点
– 特别适用于生物物质、酶制剂及同分异构体等的分离。
2021/5/3
膜纵切面模式图
28
以分离应用领域过程分类 微滤(micro-filtration, MF) 超滤(untra-filtration, UF) 反渗透(reverse osmosis, RO) 透析(Dialysis, DS) 电透析(electro-dialysis, ED) 纳米膜分离(NF) 亲和过滤(affinity filtration, AF) 渗透气化(pervaporation, PV
生物组织→ →提取液→ →粗产品→
层析法
电泳法 超离心法
→结晶
透析和超滤
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •离心
依据原理
•分子大小 •溶解度 •电荷性质 •吸附性质 •生物亲和力
凝胶的厚度不同
琼脂糖凝胶最薄只能达到３ｍｍ；聚丙烯酰胺凝胶可以制 成０.２ｍｍ，分辨率高。
成本不同。
琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高
安全性不同。
凝胶聚合的原理及有关特性
催化系统常用有两种：
过硫酸氨—TEMED化学催化聚合系统
此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能 以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫 酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生 可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具 有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。
由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝 胶浓度，但同时，也受到Leabharlann 流强度、缓冲液离子强 度等的影响。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简 称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺 （简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下 聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳（简称PAGE）。
透析浓缩法
减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压 蒸馏装置中，在减压真空状态下进行 蒸馏。
冰冻干燥法
纯度鉴定
生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯 度。
蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、 超速离心沉降分析法等。
纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速 度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋 白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。
对其他生物分子的特殊亲和力。
分离纯化的一般程序
1、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器 的分离） 3、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前 处理。
生物大分子的浓缩
沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂， 使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉 淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物， 获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。
6.支持物
现代电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同 的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色 等后续处理。
电泳技术分类
按电泳的原理来分，可分为四种：
区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系 中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。
移界电泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U 形管中进行的， 由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。
选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质 的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。
蛋白质、核酸的定性定量检测
1、蛋白质的测定
2、酶活力的测定 3、氨基酸的测定 4、核酸的测定
凯氏定氮法（含N量 6. 25）
双缩脲法、Folin-酚法 紫外光度法（max=280nm） 离心法、电泳法、层析法 终点法、动力学法 茚三酮法 Sangerf法、Edmam法、DNS法 紫外光度法（max=260nm） 分子杂交法 离心法、电泳法
由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大 超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质 间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用 Mr差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇， 巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。
琼脂糖的浓度：不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖 凝胶进行电泳分离。
2核. 琼酸脂构糖型凝与胶琼电脂泳糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：
共价闭环DNA（cccDNA）＞直线DNA＞开环的双 链环状DNA
当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不 能进入胶中，相对迁移率为0（Rf = 0），而同等大 小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进 （Rf＞0），
不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的 不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电 位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩 成很薄的起始区带，然后进行分离。
聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。
所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸 钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构， 把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包 围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的 任何电荷。
聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：
① 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。 ② 化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。 ③ 对pH和温度变化较稳定。 ④ 几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样
品分离重复性好。 ⑤ 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。 ⑥ 凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。 ⑦ 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛
生物化学研究技术方法
生物化学研究技术：
分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、离心、 层析、电泳等；
分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、 分子标记等。
分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与反 转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。
2021/5/3
5
生物大分子分离纯化的一般步骤和原则
影响泳动度的因素： 1. 电场强度：
电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。 电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。
2. 溶液pH 为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液
的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的 多少。 3.离子强度（I） 溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较 清晰。
在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷 （种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们 在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位 置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用 电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。
电泳
带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多 少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各 种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在 的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因 而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定 或纯化。
要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：
在水和各种有机溶剂中的溶解性。
在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。
固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带 电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、 在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。
其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定 性和对各种化学试剂的稳定性。
核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法 （A260/A280）等方法。
❖ 同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种 方法才能确定。
电泳基本原理
电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于 所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极 泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。
pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少 AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。
温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温 (5℃)聚合凝胶会变得脆 而混浊，一般25-35℃聚合较好。
氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱 气，再加引发剂。
PAGE原理 PAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大
类。
连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗 粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；
不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓 度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有 电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更 好。
核黄素—TEMED光聚合催化系统
此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧 氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以 加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。
凝胶聚合的原理及有关特性 影响凝胶聚合的因素
AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP应在干燥、 避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，4℃冰箱贮存，一般仅 能存放一周。TEMED（液状）应密闭贮于4℃冰箱中。增加AP和 TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶 和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。
和电荷效应为一体，因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖 电泳等有更高的分辨率。
聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：
分离范围不同
琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙 烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。
凝胶配置程序不同
琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可； 聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温 度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。
核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
DNA分子的大小：
在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反 比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的 移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。
但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难 将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因 此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过 此值。
4. 电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电
泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液 带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响， 故电泳时，电渗小些为好
5. 温度
电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率 增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电 泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。
等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、 二维电泳、脉冲场凝胶电泳。
等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各组分的区带 相随并形成清晰的界面，并以等速移动。
等电聚焦：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形 成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区 带，且分辨率较高。（表面看与区带电泳相似，但原理不同）
DNA的琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子 质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。
盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子 多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀 法；酸碱变性沉淀法等 。
吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶 吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。
超过滤法：把提取液装入过滤装置， 在空气或氮气的压力下，使小分子物 质通过半透膜，大分子物质留在膜内。
• 膜分离与常规膜的分分离离技基术相本比技术
– 具有无相变化、能耗低、过程简单、不污染环境等优 点
– 特别适用于生物物质、酶制剂及同分异构体等的分离。
2021/5/3
膜纵切面模式图
28
以分离应用领域过程分类 微滤(micro-filtration, MF) 超滤(untra-filtration, UF) 反渗透(reverse osmosis, RO) 透析(Dialysis, DS) 电透析(electro-dialysis, ED) 纳米膜分离(NF) 亲和过滤(affinity filtration, AF) 渗透气化(pervaporation, PV
生物组织→ →提取液→ →粗产品→
层析法
电泳法 超离心法
→结晶
透析和超滤
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •离心
依据原理
•分子大小 •溶解度 •电荷性质 •吸附性质 •生物亲和力
凝胶的厚度不同
琼脂糖凝胶最薄只能达到３ｍｍ；聚丙烯酰胺凝胶可以制 成０.２ｍｍ，分辨率高。
成本不同。
琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高
安全性不同。
凝胶聚合的原理及有关特性
催化系统常用有两种：
过硫酸氨—TEMED化学催化聚合系统
此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能 以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫 酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生 可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具 有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。
由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝 胶浓度，但同时，也受到Leabharlann 流强度、缓冲液离子强 度等的影响。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简 称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺 （简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下 聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳（简称PAGE）。
透析浓缩法
减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压 蒸馏装置中，在减压真空状态下进行 蒸馏。
冰冻干燥法
纯度鉴定
生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯 度。
蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、 超速离心沉降分析法等。
纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速 度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋 白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。
对其他生物分子的特殊亲和力。
分离纯化的一般程序
1、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器 的分离） 3、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前 处理。
生物大分子的浓缩
沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂， 使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉 淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物， 获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。
6.支持物
现代电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同 的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色 等后续处理。
电泳技术分类
按电泳的原理来分，可分为四种：
区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系 中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。
移界电泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U 形管中进行的， 由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。
选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质 的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。
蛋白质、核酸的定性定量检测
1、蛋白质的测定
2、酶活力的测定 3、氨基酸的测定 4、核酸的测定
凯氏定氮法（含N量 6. 25）
双缩脲法、Folin-酚法 紫外光度法（max=280nm） 离心法、电泳法、层析法 终点法、动力学法 茚三酮法 Sangerf法、Edmam法、DNS法 紫外光度法（max=260nm） 分子杂交法 离心法、电泳法
由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大 超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质 间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用 Mr差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇， 巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。
琼脂糖的浓度：不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖 凝胶进行电泳分离。
2核. 琼酸脂构糖型凝与胶琼电脂泳糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：
共价闭环DNA（cccDNA）＞直线DNA＞开环的双 链环状DNA
当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不 能进入胶中，相对迁移率为0（Rf = 0），而同等大 小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进 （Rf＞0），
不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的 不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电 位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩 成很薄的起始区带，然后进行分离。
聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。
所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸 钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构， 把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包 围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的 任何电荷。
聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：
① 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。 ② 化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。 ③ 对pH和温度变化较稳定。 ④ 几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样
品分离重复性好。 ⑤ 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。 ⑥ 凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。 ⑦ 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛
生物化学研究技术方法
生物化学研究技术：
分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、离心、 层析、电泳等；
分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、 分子标记等。
分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与反 转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。
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5
生物大分子分离纯化的一般步骤和原则
影响泳动度的因素： 1. 电场强度：
电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。 电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。
2. 溶液pH 为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液
的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的 多少。 3.离子强度（I） 溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较 清晰。
在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷 （种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们 在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位 置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用 电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。
电泳
带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多 少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各 种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在 的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因 而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定 或纯化。
要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：
在水和各种有机溶剂中的溶解性。
在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。
固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带 电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、 在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。
其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定 性和对各种化学试剂的稳定性。
核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法 （A260/A280）等方法。
❖ 同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种 方法才能确定。
电泳基本原理
电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于 所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极 泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。
pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少 AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。
温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温 (5℃)聚合凝胶会变得脆 而混浊，一般25-35℃聚合较好。
氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱 气，再加引发剂。
PAGE原理 PAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大
类。
连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗 粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；
不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓 度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有 电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更 好。
核黄素—TEMED光聚合催化系统
此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧 氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以 加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。
凝胶聚合的原理及有关特性 影响凝胶聚合的因素
AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP应在干燥、 避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，4℃冰箱贮存，一般仅 能存放一周。TEMED（液状）应密闭贮于4℃冰箱中。增加AP和 TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶 和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。
和电荷效应为一体，因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖 电泳等有更高的分辨率。
聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：
分离范围不同
琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙 烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。
凝胶配置程序不同
琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可； 聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温 度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。
核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
DNA分子的大小：
在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反 比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的 移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。
但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难 将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因 此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过 此值。
4. 电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电
泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液 带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响， 故电泳时，电渗小些为好
5. 温度
电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率 增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电 泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。