CTAB法提取植物基因组DNA

CTAB法提取植物基因组DNA
CTAB法提取植物基因组DNA
CTAB法原理
CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），⼗六烷基三甲基溴化铵，是⼀种阳离⼦去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离⼦强度溶液中沉淀核酸的特性。

当降低溶液盐浓度到⼀定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离⼼就可将其与蛋⽩，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋⽩，多糖，酚类等杂质。

最后通过⼄醇或异丙醇沉淀DNA，⽽CTAB溶于⼄醇或异丙醇⽽除去在⾼离⼦强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋⽩质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。

CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加⼊冰冷的植物材料之前必须预热，且离⼼时温度不要低于15℃。

另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

主要试剂与溶液的配制：
PVP（聚⼄烯吡咯烷酮K30）
巯基⼄醇
氯仿︰异戊醇（24︰1）
异丙醇
70%⼄醇
Tris-苯酚
RNaseA
⽆⽔⼄醇
CTAB 溶液：CTAB——20g/L
NaCl（58.44）——1.4 mol/L（81.816g）
EDTA（292.25）——10 mmol/L（2.9225g）
Tris（121.14）——100 mmol/L（12.114g）
pH 8.0
1×TE 缓冲液：EDTA（292.25）——1 mmol/L（0.29225g）
Tris（121.14）——10 mmol/L（1.2114g）
pH 8.0
NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）
pH 4.0
植物总DNA的提取
1、取适量⽢薯新鲜叶⽚，⽤液氮迅速研磨，中间加PVP（聚⼄烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转⼊10mL的离⼼管中，放⼊液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差⼏倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨⼏次）。

2、将（200ml）CTAB溶液放于65℃⽔浴锅中预热。

3、加4ml巯基⼄醇到预热的200mlCTAB中。

4、速加3ml预热的CTAB到装有粉末的10mL离⼼管中，之后放⼊65℃⽔浴锅中，保温
30~60min，期间轻摇数次（⼀般20min左右⼀次，刚投⼊⽔浴时可以稍快速的晃动，之后的晃
动⼀定要轻柔）。

5、加⼊3~4ml氯仿︰异戊醇（24︰1）（在通风橱中操作），轻摇混匀⾄乳⽩⾊（100~200次，剧烈晃动会使DNA机械切割）。

6、15~20℃，11000 rpm离⼼15min（CTAB配平，相对应的离⼼管，质量相差<0.03g）。

7、取上清（⽤剪过的枪头进⾏操作，过尖的枪头会把DNA链弄断。

），加0.6倍体积的异丙醇，摇均（有絮状物析出，可放⼊4℃冰箱过夜）。

8、⽤⽑细玻璃管将DNA絮状物挑出（DNA絮状物尽量要挑出，不要离⼼，因为离⼼后虽然产量会增⼤，但是不完整的DNA 也增多）（或4℃，10000 rpm离⼼5min，弃上清），放⼊新的离⼼管中，⽤70%⼄醇漂洗2次，放置超净台中吹⼲。

9、加⼊2ml 1×TE缓冲液溶解，可放⼊4℃冰箱保存（酶活性在4℃或65℃⽔浴中最低，防⽌酶降解DNA）。

10、未溶解的，可放⼊65℃⽔浴中促其溶解，10min后拿出冷却⾄室温，可重复，直⾄溶解。

11、加⼊2.5ul RNaseA（RNaseA提前拿出融化），10℃离⼼，升⾄4000 rpm即停，使RNaseA 和溶液充分混合。

12、37℃⽔浴，保温1h。

13、加⼊1ml Tris-苯酚、1ml氯仿︰异戊醇（24︰1），摇均配平，4℃，11000 rpm离⼼10min。

14、取上清，加1×TE补⾄2ml，加2ml氯仿︰异戊醇（24︰1）摇均配平，4℃，11000 rpm 离⼼10min。

15、如仍有⽩⾊蛋⽩质沉淀，则重复步骤14。

16、取上清，加0.1倍上清液体积的NaAC，2.5倍上清液体积的⽆⽔⼄醇（提前放⼊-20℃冰箱），摇均，放⼊-20℃冰箱沉淀30min。

17、⽤⽑细玻璃管将DNA挑出（或⽤⽆⽔⼄醇配平，4℃，10000 rpm离⼼4min，弃上清），放⼊新的离⼼管中，⽤70%⼄醇漂洗2次，转⼊1.5ml离⼼管，放置超净台中吹⼲。

18、将DNA 溶于适量的1×TE缓冲液中，短期4℃保存，长期-80℃冰箱中储存。

19、取少量DNA溶液进⾏琼脂糖电泳，胶浓度为0.8%，检测其完整性。

并⽤紫外分光光度计测其浓度。

注解：
1、PVP(聚⼄烯吡咯烷酮)：是酚的络合物，能与多酚形成⼀种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

2、CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
3、NaCl：提供⼀个⾼盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；
4、EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离⼦，抑制DNase活性；
5、Tris (pH8.0)：提供⼀个缓冲环境，防⽌核酸被破坏；
6、β-巯基⼄醇：是抗氧化剂，有效地防⽌酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

7、苯酚：使蛋⽩质变性，同时抑制了DNase的降解作⽤。

⽤苯酚处理匀浆液时，由于蛋⽩与DNA 联结键已断,蛋⽩分⼦表⾯⼜含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋⽩分⼦溶于酚相，⽽DNA溶于⽔相。

使⽤酚的优点：（1）有效变性蛋⽩质；（2）抑制了DNase的降解
作⽤。

缺点：（1）能溶解10-15%的⽔，从⽽溶解⼀部分poly(A)RNA。

（2）不能完全抑制RNase 的活性。

8、氯仿：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。

最后⽤氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。

9、异戊醇：减少蛋⽩质变性操作过程中产⽣的⽓泡。

异戊醇可以降低表⾯张⼒，从⽽减少⽓泡产⽣。

另外，异戊醇有助于分相，使离⼼后的上层含DNA的⽔相、中间的变性蛋⽩相及下层有机溶剂相维持稳定。

基因组DNA提取常见问题：
1、DNA中含有蛋⽩、多糖、多酚类杂质：重新纯化DNA，去除蛋⽩、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA。

2、DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：让酒精充分挥发，增加70%⼄醇洗涤的次数(2-3次)
3、DNA中有RNA的存留：加⼊RNase降解RNA。

4、材料不新鲜或反复冻融：尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加⼊裂解缓冲液。

5、未很好抑制内源核酸酶的活性：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。

6、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

7、外源核酸酶污染：所有试剂⽤⽆菌⽔配制，耗材经⾼温灭菌。

8、反复冻融。

将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

冰冻材料提出⾼质量的基因组DNA，应确保以下⼏点：
1、确保采样后⽴即投⼊液氮中保存。

2、在磨样时⼀定要⼀直使材料处于低温状态。

研磨前先将液氮倒⼊研钵，研钵彻底冷却后，再放⼊材料，研磨过程中，⼀定不要让液氮挥发净使材料回温，否则会DNA降解得很厉害。

装管的时候，先将⼏个离⼼管放⼊⼀个装有液氮的容器内，将其冷冻⼀下，使之处于低温状态，将液氮还为挥发⼲净的材料放⼊管内，不要急着盖盖⼦，因为液氮不挥发⼲净就盖上会再次弹开。

将离⼼管放⼊盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发⼲净盖上盖⼦即可。

另外，如果是在离⼼管上编号，最好在冷冻前写好，否则离⼼管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。