专题1 1.2 基因工程的基本操作程序

(2)利用 PCR 技术扩增目的基因： ①原理： DNA 复制 。 ②前提条件：有一段已知目的基因的 核苷酸序列 ，以 便根据这一序列合成 引物 。 ③条件：DNA 模板、 引物 、 热稳定 DNA 聚合酶和 4 种脱氧核苷酸。
。
1．提取目的基因方法的比较基因的构建方法 基因组文 部R技术法 基因组 库(如cDNA 扩增)
人工合成
优 点
操作简单
专一性强
可在短时间 内大量扩增 目的基因
专一性强，可 产生自然界中 不存在的新基 因
(2)导入动物细胞：
①方法：显微注射 技术。
②常用受体细胞： 受精卵 。
(3)导入微生物细胞： ①原核生物的特点： 繁殖快 物质相对 较少 等。
、多为 单细胞 、遗传
②方法：感受态细胞法，即用 Ca2＋ 处理细胞，使细
胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态(这 种细胞称为 感受态细胞 )。
(4)EcoRⅠ和 BamHⅠ
(1)切割目的基因和载体时并非只能用一种酶，但 无论用几种酶，一般都用相同种类的酶切割目的基因和 载体。
(2)启动子≠起始密码，终止子≠终止密码。 启动子和终止子位于基因结构的非编码区，起始密 码和终止密码位于 mRNA 上。
目的基因的导入和检测
[例 3] 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然 条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。 下面是农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：
目的基因的检测与鉴定 [自读教材·夯基础]
1．分子水平的检测[连线]
2．个体水平的鉴定 (1) 抗虫或抗病 的接种实验。 (2)对基因工程产品与天然产品的功能进行 活性比较 。
1．检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方 法是什么？
提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。 2．DNA 分子杂交的原理是什么？有哪些应用？ 提示：碱基互补配对原则。可用于亲子鉴定、刑事侦 查、生物亲缘关系确定等。
(2)根据 T-DNA 这一转移特点，猜测该 DNA 片段上可能 含有控制____________(酶)合成的基因。
(3)图中 c 过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的 物质是________类化合物。
(4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的 方法除了农杆菌转化法之外，还可采取的方法是 _____________________术扩增 DNA 与 DNA 体内复制的不同点。
提示：①PCR 技术扩增 DNA 不需要解旋酶；②PCR 技 术需要的 DNA 聚合酶应具有热稳定性。
[跟随名师·解疑难]
基因枪法、花粉 技术 法
管通道法
体细胞
受精卵 原核细胞
受体 细胞
转化 过程
植物细胞
动物细胞 微生物细胞
以农杆菌转化法为 例： 将目的基因插入Ti 质粒的T-DNA上
↓ 转入农杆菌中
↓ 导入植物细胞
↓ 整合到受体细胞的 DNA上
提纯含目 的基因的 表达载体
↓ 显微注射
↓ 受精卵发 育
↓ 具有新过中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因比较小，即可依照某一蛋白质的 氨基酸序列，通过密码子推测出其核苷酸序列，然后直接合成 目的基因，其过程如下：
[特别提醒] (1)基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启动子 才比较有导入受体细胞中无法转录。
缺 点
工作量大、 盲目性大、 专一性差
操作过程较 需要严格控 麻烦，技术 制温度，技 要求过高 术要求高
适用范围小
2．人工合成目的基因常用方法 (1)反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其 序列的基因，它是以目的基因的 mRNA 为模板，借助反转 录酶合成碱基互补的单链 DNA，然后在 DNA 聚合酶的作 用下合成双链 DNA，其过程如下：
[思路点拨]
[解析] 分析该是逆转录酶；A、 C 过程虽然都能获得含目的基因的菌株，但 C 中无内含子对应 的序列，所以不可以使用同一种探 cDNA 为模板直接进行 PCR 扩增，该过程中所用酶的显著特 点是耐高温。
[跟随名师·解疑难]
目的基因的检测与鉴定归纳
目的基因的获取方法
[例 1] 为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因 导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流 __________ ； A 、 C 过 程 中 ______(填“可以”或“不可以”)使用同一种探针筛选含 目的基因的_____和__________为模板直接进行 PCR 扩增，该过程中所用酶的显著特点是___________。
(3)目的基因表达时，RNA 聚合酶识别和结合的位点是 ________，其合成的产物是________。
(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产 生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________。
[思路点拨]
[解析] (1)将含有目的基因的 DNA 与质粒分别用 EcoRⅠ酶切，所产生的黏性末端相同，用 DNA 连接酶 处理后，不同的片段随机结合，可形成 3 种不同的连接 物：目的基因—目的基因、目的基因—运载体、运载体 —运载体。(2)在上述三种产物中，插入目的基因的都不 能在四环素培养基上生长，只有运载体—运载体连接产 物才能在含四环素的培养基上生长。
[跟随名师·解疑难]
1．基因表达载体的构建过程 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量 DNA 接酶，形成一个重组 DNA 分子(重组质粒)。构建过 程如图所示：
2．将目的基因导入受体细胞的方法比较
受体 细胞
常用 方法
受体 细胞
植物细胞
动物细胞 微生物细胞
农杆菌转化法、 显微注射 感 受 态 细 胞
[答案] (1)大于 (2)逆转录酶 不可以 (3)DNA cDNA 耐高温
真核细胞基因结构 (1)结构编非码编区码：区内：含启子动、子外、显终子止子
(2)表达：只有编码区能转录生成 RNA，且内含子转 录的部分要剪切掉，即转录生成的 mRNA 只有外显子对 应部分。因此，以 mRNA 为模板，逆转录产生的目的基 因中没有内含子、启动子和终止子。
1.2
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
[自读教材·夯基础]
1．目的基因 (1)主要是指 编码蛋白质 的基因。 (2)也可以是一些具有 调控作用 的物不同基因的许多 _D__N_A__片__段___，导入 受体菌 的群体中储存，各个受体菌分 别含有这种生物的不同的基因。 ②
(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是________，利用 农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现______________。 具体原理是在农杆菌的 Ti 质粒存在 T-DNA 片段，它具有可 转移到受体细胞并整合到受体细胞的________上的特点，因 此只要将携带外源基因的 DNA 片段插入到________(部位)内 部即可。
Ca2＋处理细胞 ↓
感受态细胞 ↓
基因表达载体 与感受态细胞 混合
↓ 感受态细胞 吸收DNA分子
[特别提醒] (1)完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切 酶和 DNA 连接酶，连接产物有目的基因—目的基因，目 的基因—载体和载体—载体三种。 (2)将基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌的常用方 法是 Ca2＋处理法。Ca2＋(或 CaCl2 溶液)对微生物细胞的作 用是增加细胞壁的通透性。
基因表达载体的构建和目的基因的导入
[自读教材·夯基础]
1．基因表达载体的构建 (1)目的：使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且 可以遗传和 表达 。
(2)组成：
2．将目的基因导入受体细胞 (1)导入植物细胞： ①农杆菌原理：农杆菌Ti质粒上的 T-DNA 可整合
转化法到适受用体范细围胞：的主染要色适体用D于N双A上子叶植物 和裸子植物 ② 基因枪法：常用于单子叶植物。 ③花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
(3)启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的位点，可启动 转录过程，合成 mRNA。(4)由图示和题目中提供的信息可 知，同时运用 EcoRⅠ和 BamHⅠ进行酶切可有效防止酶切 后产生的末端发生任意连接。
[答案] (1)目的基因—载体连接物 载体—载体连接 物 目的基因—目的基因连接物
(2)载体—载体连接物 目的基因—载体连接物、载体 —载体连接物 (3)启动子 mRNA
解析：由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以 mRNA
反转录成的 DNA 就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等
非编码区段，和原来的基因结构不相同。
答案：B
基因表达载体的构建
[例 2] 右图为某种质粒表达载体简 图，小箭头所指分别为限制性核酸内切 酶 EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampr 为氨苄青霉素抗性基因，tetr 为四环素抗 性基因，P 为启动子，T 为终止子，ori 为复制原点。已知 目的基因的两端分别有包括 EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种 酶的酶切位点。
1．思考基因表达载体的构建需要哪些工具酶。 提示：限制酶、DNA 连接酶。 2．结合教材 P13 资料卡分析，用花粉管通道法导入 受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原 因。 提示：需要。因为目的基因只有和载体结合成基因 表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。
3．为什么动物的体细胞不能作为受体细胞？ 提示：动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一 个新个体。 4．从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人 的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？ 提示：不可以。糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔 基复合体上加工完成的，而内质网和高尔基复合体存在 于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这 两种细胞器。
[思路点拨]
[解析] (1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可 感染双子叶植物和裸子植物，利用其感染性，可实现将目的基 因导入植物细胞。这里需要特别明确的是真正可转移到受体细 胞并整合到受体细胞的染色体上的是农杆菌质粒上的 T-DNA 片段，因此目的基因必须插入到该部位才能导入成功。(2)根据 T-DNA 这一转移特点，可以推测出 DNA 片段上能控制合成 DNA 连接酶、限制酶才能实现与双子叶植物细胞染色体 DNA 的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类化合物，促进农杆菌向 植物细胞转移。(4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的 方法除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法。
据图回答： (1)将含有目的基因的 DNA 与质粒分别用 EcoRⅠ酶切，酶 切产物用 DNA 连接酶进行连接后，其中由两个 DNA 片段之间 连接形成的产物有__________、_________、_____________三种。 (2)用上述 3 种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进 行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中， 能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有________________； 若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的 连接产物有____________。