感受态细胞制备ppt实用资料
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
实验注意事项
1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃ 的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用 于制备感受态细胞的菌液。
L加再密B去将度液离 该 过体子菌高培水悬或养至液不基总以足：体均称1:积会取10影1蛋0L响-，白1:转高胨5化0压(T的效下ry比p率蒸to例。气n接e灭)1种菌0于2g0，1m0酵0inm母。L提L取B液物体(Y培ea养st基ex中tr，ac3t)75℃g振，荡N培aC2养l 120-g3，h 至溶O于D860000m为l去。离子水中，用 NaOH 调pH至，
2. 影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？
L感B受固态体细培胞养分基装：成液体20培0μ养L的基小中份每，升贮加存12于g琼-7脂0℃粉可，保高存压半灭年菌。。
② 弃去上清，用预冷的 mol/L 的CaCl 溶液10mL轻轻悬浮细胞， D感H受5α态菌细株胞的的O制D备600( 为Ca时C，l2细法胞) 密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。
③ 25溶0m液L重：蒸称水取中0.，28定g 容Ca至C1l20(0无m水L，,分高析压纯灭)菌，。溶于
实验仪器
台式高速冷 冻离心机
恒温摇床
制冰机
实验步骤
1. 菌体的培养
① 受 体 菌 的 培 养 从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α 单 菌 落 ， 接 种 于 3-5mL LB液体培养基中， 37℃下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。
离心10min。 coli DH5α单菌落，接种于3-5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。
L将B经固过体转培化养后基的：细液胞体在培筛养选基培中养每基升中加培12养g琼，脂即粉可，筛高选压出灭转菌化。子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
2. 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测 培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为时，细胞 密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或 不足均会影响转化效率。
3. 实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造受态细胞的实验中要注意哪些 细节？
实验材料和试剂
实验材料：E. coli DH5α菌(R-，M-，Amp-)。 实验试剂： ① LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵
母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于 800ml去离子水中，用 NaOH 调pH至，加去离 子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。 ② LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉， 高压灭菌。
受LB体液菌体的培培养养基从：称LB取平蛋板白上胨挑(T取ry新pt活on化e)的10Eg.，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用 NaOH 调pH至，
密加度去过 离高子或水不至足总均体会积影1L响，转高化压效下率蒸。气灭菌20min。
④ 感受态细胞分装成 200μL的小份，贮存于-70℃可保存半年。 细将胞培生 养长液密转度入以离刚心进管入中对，数冰生上长放期置时10为mi宜n，，然可后通于过4监℃测下培30养00液g的离O心D1600m0in来。控制。
③ 弃去上清，加入 4mL预冷含15%甘油的 溶液，轻轻悬浮细 2受8体g C菌a的Cl培2(养无从水,L分B析平纯板)，上溶挑于取5新0m活L化重的蒸E水. 中，定容至100mL，高压灭菌。
2感8受g C态a细Cl胞2(制无备水,分析纯)，溶于50mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。
2
胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。 将Pr经ep过ar转ati化on后of的c细om胞pe在te筛nt选ce培ll养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
冰上放置 15-30 min 后，4℃ 下 3000g 离心10 min。 受在体制菌 备的感培受养态从细胞LB的平实板验上中挑要取注新意活哪化些的E.
将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min。
将28培g C养a液Cl转2(入无离水心,分管析中纯，)，冰溶上于放5置0m10Lm重i蒸n，水然中后，于定4容℃至下130000m0gL离，心高1压0m灭i菌n。。
实验五
感受态细胞制备
Preparation of competent cell
实验原理
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2、 RbCl等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发 生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进 入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞 的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移， 使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细 胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子 （ Transformant ， 即 带 有 异 源 DNA 分 子 的 受 体 细 胞）。
② 再将该菌悬液以 1: 100-1: 50 的比例接种于100mL
LB液体培养基中，37℃振荡培养 2-3h 至OD600 为 。
2. 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
① 将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g 受体菌的培养从 LB 平板上挑取新活化的E.
再将该菌悬液以 1: 100-1: 50 的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养 2-3h 至OD600为。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
实验注意事项
1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃ 的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用 于制备感受态细胞的菌液。
L加再密B去将度液离 该 过体子菌高培水悬或养至液不基总以足：体均称1:积会取10影1蛋0L响-，白1:转高胨5化0压(T的效下ry比p率蒸to例。气n接e灭)1种菌0于2g0，1m0酵0inm母。L提L取B液物体(Y培ea养st基ex中tr，ac3t)75℃g振，荡N培aC2养l 120-g3，h 至溶O于D860000m为l去。离子水中，用 NaOH 调pH至，
2. 影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？
L感B受固态体细培胞养分基装：成液体20培0μ养L的基小中份每，升贮加存12于g琼-7脂0℃粉可，保高存压半灭年菌。。
② 弃去上清，用预冷的 mol/L 的CaCl 溶液10mL轻轻悬浮细胞， D感H受5α态菌细株胞的的O制D备600( 为Ca时C，l2细法胞) 密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。
③ 25溶0m液L重：蒸称水取中0.，28定g 容Ca至C1l20(0无m水L，,分高析压纯灭)菌，。溶于
实验仪器
台式高速冷 冻离心机
恒温摇床
制冰机
实验步骤
1. 菌体的培养
① 受 体 菌 的 培 养 从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α 单 菌 落 ， 接 种 于 3-5mL LB液体培养基中， 37℃下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。
离心10min。 coli DH5α单菌落，接种于3-5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。
L将B经固过体转培化养后基的：细液胞体在培筛养选基培中养每基升中加培12养g琼，脂即粉可，筛高选压出灭转菌化。子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
2. 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测 培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为时，细胞 密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或 不足均会影响转化效率。
3. 实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造受态细胞的实验中要注意哪些 细节？
实验材料和试剂
实验材料：E. coli DH5α菌(R-，M-，Amp-)。 实验试剂： ① LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵
母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于 800ml去离子水中，用 NaOH 调pH至，加去离 子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。 ② LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉， 高压灭菌。
受LB体液菌体的培培养养基从：称LB取平蛋板白上胨挑(T取ry新pt活on化e)的10Eg.，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用 NaOH 调pH至，
密加度去过 离高子或水不至足总均体会积影1L响，转高化压效下率蒸。气灭菌20min。
④ 感受态细胞分装成 200μL的小份，贮存于-70℃可保存半年。 细将胞培生 养长液密转度入以离刚心进管入中对，数冰生上长放期置时10为mi宜n，，然可后通于过4监℃测下培30养00液g的离O心D1600m0in来。控制。
③ 弃去上清，加入 4mL预冷含15%甘油的 溶液，轻轻悬浮细 2受8体g C菌a的Cl培2(养无从水,L分B析平纯板)，上溶挑于取5新0m活L化重的蒸E水. 中，定容至100mL，高压灭菌。
2感8受g C态a细Cl胞2(制无备水,分析纯)，溶于50mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。
2
胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。 将Pr经ep过ar转ati化on后of的c细om胞pe在te筛nt选ce培ll养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
冰上放置 15-30 min 后，4℃ 下 3000g 离心10 min。 受在体制菌 备的感培受养态从细胞LB的平实板验上中挑要取注新意活哪化些的E.
将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min。
将28培g C养a液Cl转2(入无离水心,分管析中纯，)，冰溶上于放5置0m10Lm重i蒸n，水然中后，于定4容℃至下130000m0gL离，心高1压0m灭i菌n。。
实验五
感受态细胞制备
Preparation of competent cell
实验原理
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2、 RbCl等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发 生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进 入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞 的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移， 使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细 胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子 （ Transformant ， 即 带 有 异 源 DNA 分 子 的 受 体 细 胞）。
② 再将该菌悬液以 1: 100-1: 50 的比例接种于100mL
LB液体培养基中，37℃振荡培养 2-3h 至OD600 为 。
2. 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
① 将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g 受体菌的培养从 LB 平板上挑取新活化的E.
再将该菌悬液以 1: 100-1: 50 的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养 2-3h 至OD600为。