保持维生素D水溶液稳定的组合物及其制备方法和应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010997438.7
(22)申请日 2020.09.21
(71)申请人 上海科华生物工程股份有限公司
地址 200233 上海市徐汇区钦州北路1189
号
(72)发明人 李润留　
(74)专利代理机构 上海容慧专利代理事务所
(普通合伙) 31287
代理人 于晓菁
(51)Int.Cl.
G01N 33/96(2006.01)
G01N 33/82(2006.01)
(54)发明名称
保持维生素D水溶液稳定的组合物及其制备
方法和应用
(57)摘要
本发明提供了一种保持维生素D水溶液稳定
的组合物，其特征在于，包括以下组分：光稳定
剂、缓冲液、蛋白类物质、防腐剂以及盐类，并进
一步提供了其制备方法以及在制备维生素D校准
品和质控品中的用途；本发明所述的组合物，能
够显著保持维生素D水溶液稳定，制备工艺简单，
利于实施和工业化生产，具有良好的市场应用前
景。

权利要求书1页 说明书4页CN 112098663 A 2020.12.18
C N 112098663
A
1.一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，其特征在于，包括以下组分：光稳定剂、缓冲液、蛋白类物质、防腐剂以及盐类稳定剂。

2.根据权利要求1所述的保持维生素D水溶液稳定的组合物，其特征在于，所述的光稳定剂为六甲基磷酰三胺，其在所述组合物中的浓度为0.5～1g/L。

3.根据权利要求1所述的保持维生素D水溶液稳定的组合物，其特征在于，所述缓冲液选自三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸缓冲盐溶液、2-(N -吗啉代)乙磺酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、N -三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液、3-(N -吗啉基)丙磺酸中的一种或几种，其在组合物中的浓度为10～100mmol/L；优选的，所述缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液，其pH为7.2～7.8。

4.根据权利要求1所述的保持维生素D水溶液稳定的组合物，其特征在于，所述蛋白类物质选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白，免疫球蛋白中的一种或多种，其在所述组合物中的浓度为5～20g/L；优选的，所述蛋白类物质为BSA。

5.根据权利要求1所述的保持维生素D水溶液稳定的组合物，其特征在于，所述防腐剂选自Proclin 300、甲基异噻唑啉酮、Bro、IPBC、NaN 3中的一种或多种，其在所述组合物中的浓度为0.5～2g/L；优选的，所述防腐剂为Proclin 300。

6.根据权利要求1所述的保持维生素D水溶液稳定的组合物，其特征在于，所述盐类稳定剂为NaCl，其在组合物中的浓度为50～300mmol/L。

7.一种权利要求1～6任一项所述的保持维生素D水溶液稳定的组合物的制备方法，包括以下步骤：按照上述配方比例取一定体积的缓冲液，然后按照上述配方比例取其余组分后将其溶解于缓冲液，混合均匀，即得。

8.一种权利要求1～6任一项所述保持维生素D水溶液稳定的组合物在制备维生素D校准品或质控品中的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 112098663 A
保持维生素D水溶液稳定的组合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物体外诊断技术，具体涉及保持维生素D溶液稳定的组合物及其制备方法和应用。

背景技术
[0002]维生素D是人体必需的一类脂溶性类固醇激素，具有增加肠钙吸收、保持钙磷平衡、促进骨代谢、抑制PTH分泌等调控骨钙代谢功能，人类每天必需从食物中摄取适量的维生素D，才能维持正常的发育和健康。

人体内的维生素D主要来源于皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射转变成维生素D3，此外还包括从鱼、肉等食物中摄取的维生素D3和膳食补充剂中的维生素D2。

无论哪种形式的维生素D，在血液中均与结合蛋白结合后运输至肝脏，在肝脏中被转换成为25-羟基维生素D，而后在肾脏中被转化为1,25-双羟基维生素D，这是维生素D发挥作用的生物活性成分。

但循环中的1,25-双羟基维生素D含量极少，而循环中的25-羟基维生素D含量是1,25-双羟基维生素D的1000倍，是维生素D在循环中的主要存在形式，能够反映人体维生素D的真实水平，是反映个体维生素D状态的最佳指标。

[0003]维生素D主要有D2和D3两种形式，两者结构十分相似，只是侧链有差别，维生素D2的侧链上多一个甲基，而维生素D3的侧链上多一个甲基和双键。

维生素D是无色晶体，溶于脂肪，脂溶剂及有机溶媒中，化学性质稳定，在中性和碱性溶液中耐热，不易被氧化，但维生素D及其代谢产物不溶于水，易溶于乙醇，且化学性质不稳定，容易在光照和湿热条件下发生分解而失去活性。

因此，维生素D一般应存于无光，无酸，无氧或氮气的低温环境中。

[0004]目前已有可供临床检测使用的商品化试剂盒，多采用化学发光法(CLIA)和乳增强免疫比浊法(PETIA)。

化学发光法和乳增强免疫比浊法具有反应时间短、灵敏度高、特异性好、线性范围宽、重复性好等优点。

然而作为检测试剂盒的重要组成的校准品往往会因为均匀性和溶解度较差，对光敏感稳定性不好，从而导致稳定性差，影响检测结果。

因此，我们亟需一种能完全溶解维生素D的含有紫外线光稳定剂的水溶性溶液，用来制备检测维生素D的校准品。

发明内容
[0005]为克服现有技术缺陷，本发明提供了以下技术方案：
[0006]本发明的第一方面提供了一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，包括以下组分：光稳定剂、缓冲液、蛋白类物质、防腐剂以及盐类稳定剂；
[0007]进一步的，所述的光稳定剂为六甲基磷酰三胺(即HEMPA)，其在所述组合物中的浓度为0.5～1.0g/L；优选的，其在所述组合物中的浓度为0.8g/L；
[0008]进一步的，所述缓冲液选自三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(即Tris-HCl缓冲液)、磷酸缓冲盐溶液(即PBS缓冲液)、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(即MES缓冲液)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(即HEPES缓冲液)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液(即TAPS 缓冲液)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(即MOPS缓冲液)中的一种或几种，其在组合物中的浓度为10
～100mmol/L；优选的，其在组合物中的浓度为50mmol/L；进一步优选的，所述缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(即Tris-HCl缓冲液)，其pH为7.2～7.8；
[0009]进一步的，所述蛋白类物质选自牛血清白蛋白(即BSA)、人血清白蛋白(即HSA)、酪蛋白(即CS)，免疫球蛋白(即Ig)中的一种或多种，其在所述组合物中的浓度为5.0～20g/L；优选的，其在所述组合物中的浓度为10g/L；进一步优选的，所述蛋白类物质为BSA；[0010]进一步的，所述防腐剂选自Proclin 300、甲基异噻唑啉酮(即MIT)、Bro、IPBC、NaN3中的一种或多种，其在所述组合物中的浓度为0.5～2.0g/L；优选的，其在所述组合物中的浓度为1.0g/L；进一步优选的，所述防腐剂为Proclin 300；
[0011]进一步的，所述盐类稳定剂NaCl，其在组合物中的浓度为50～300mmol/L；优选的，其在组合物中的浓度为180mmol/L。

[0012]本发明的第二方面提供了上述任一种保持维生素D水溶液稳定的组合物的制备方法，包括以下步骤：按照上述配方比例取一定体积的缓冲液，然后按照上述配方比例取其余组分后将其溶解于缓冲液，混合均匀，即得；
[0013]本发明的第三方面提供了上述任一种保持维生素D水溶液稳定的组合物在制备维生素D校准品或质控品中的应用。

[0014]有益效果
[0015](1)本发明所述的保持维生素D水溶液稳定的组合物，通过在组合物中添加合理配比的光稳定剂、缓冲液、蛋白类物质、防腐剂以及盐类盐类，显著提升了维生素D水溶液校准品的稳定性，提升了测量结果的稳定性；
[0016](2)本发明组合物采用六甲基磷酰三胺作为光稳定剂，可有效地吸收波长为270～380nm的紫外光，光稳定性、热稳定性以及化学稳定性均良好，不分解不变色、贮存稳定性好、不与维生素D水溶液中其它组分发生反应；且其混溶性好，均匀的分散在维生素D溶液中，与多种高聚物相容性良好；且该品无毒无色无臭不易燃、不腐蚀，兼具有极高的安全性；[0017](3)本发明采用的防腐剂Proclin 300以其广谱活性、优越的相容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。

Proclin 300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间；其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中；特别是，Proclin 300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂的实验结果；
[0018](4)本发明采用NaCl作为盐类稳定剂进一步稳定组合物中的其余组分以及VD的溶解和稳定性；
[0019](5)本发明的制备条件以及制备工艺简单，利于实施和工业化生产，具有良好的市场应用前景。

具体实施方式
[0020]说明：本发明实施例和实验例中所用的材料和试剂均是市售可得的。

[0021]实施例1：
[0022]一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，包括以下组分：光稳定剂六甲基磷酰三胺0.5g/L、Tris-HCl缓冲液10mmol/L(其pH为7.5)、蛋白类物质BSA 5.0g/L、防腐剂Proclin 300 0.5g/L以及盐类稳定剂NaCl 50mmol/L；其制备发方法包括以下步骤：取100ml、
10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后按比例称取上述各组分六甲基磷酰三胺0.05g、BSA 0.5g、防腐剂Proclin 300 0.05g以及NaCl 0.29g，将上述物质充分溶解在Tris-HCl缓冲液中，即得。

[0023]实施例2：
[0024]一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，包括以下组分：光稳定剂六甲基磷酰三胺1.0g/L、Tris-HCl缓冲液100mmol/L(其pH为7.5)、蛋白类物质BSA 20g/L、防腐剂Proclin 300 2g/L以及盐类NaCl 300mmol/L；其制备发方法包括以下步骤：取100ml、100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后按比例称取上述各组分六甲基磷酰三胺0.1g、BSA 2g、防腐剂Proclin 300 0.2g以及NaCl 1.76g，将上述物质充分溶解在Tris-HCl缓冲液中，即得。

[0025]实施例3
[0026]一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，包括以下组分：光稳定剂六甲基磷酰三胺0.8g/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L(其pH为7.5)、蛋白类物质BSA 10.0g/L、防腐剂Proclin 300 1.0g/L以及盐类NaCl 180mmol/L；其制备发方法包括以下步骤：取100ml、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后按比例称取上述各组分六甲基磷酰三胺0.08g、BSA 1.0g、防腐剂Proclin 300 0.1g以及NaCl 1.05g，将上述物质充分溶解在Tris-HCl缓冲液中，即得。

[0027]对比例1：
[0028]一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，包括以下组分：光稳定剂7-脱氢胆固醇0.5g/L、Tris-HCl缓冲液10mmol/L(其pH为7.5)、蛋白类物质BSA 5.0g/L、防腐剂Proclin 300 0.5g/L以及盐类稳定剂NaCl 50mmol/L；其制备发方法包括以下步骤：取100ml、10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后按比例称取上述各组分六甲基磷酰三胺0.05g、BSA 0.5g、防腐剂Proclin 300 0.05g以及NaCl 0.29g，将上述物质充分溶解在Tris-HCl缓冲液中，即得。

[0029]对比例2：
[0030]一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，包括以下组分：光稳定剂7-脱氢胆固醇1.0g/L、Tris-HCl缓冲液100mmol/L(其pH为7.5)、蛋白类物质BSA 20g/L、防腐剂Proclin 300 2g/L以及盐类NaCl 300mmol/L；其制备发方法包括以下步骤：取100ml、100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后按比例称取上述各组分六甲基磷酰三胺0.1g、BSA 2g、防腐剂Proclin 300 0.2g以及NaCl 1.76g，将上述物质充分溶解在Tris-HCl缓冲液中，即得。

[0031]对比例3：
[0032]一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，包括以下组分：光稳定剂7-脱氢胆固醇0.8g/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L(其pH为7.5)、蛋白类物质BSA 10.0g/L、防腐剂Proclin 300 1.0g/L以及盐类NaCl 180mmol/L；其制备发方法包括以下步骤：取100ml、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后按比例称取上述各组分六甲基磷酰三胺0.08g、BSA 1.0g、防腐剂Proclin 300 0.1g以及NaCl 1.05g，将上述物质充分溶解在Tris-HCl缓冲液中，即得。

[0033]对比例4
[0034]一种保持维生素D水溶液稳定的组合物，包括以下组分：光稳定剂六甲基磷酰三胺0.8g/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L(其pH为7.5)、蛋白类物质BSA 10.0g/L以及防腐剂Proclin 300 1.0g/L；其制备发方法包括以下步骤：取100ml、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后按比例称取上述各组分六甲基磷酰三胺0.08g、BSA 1.0g以及防腐剂Proclin 300
0.1g，将上述物质充分溶解在Tris-HCl缓冲液中，即得。

[0035]实验例1：校准品的稳定性实验
[0036]将实施例1～3以及对比例1～3制备的组合物作为校准品1，校准品2-5中分别添加不同浓度的维生素D(即VD)水溶液，然后光照3天进行检测，吸光度值结果如下表1所示。

[0037]表1
[0038]
[0039]由此可见，实施例1～3、对比例1～3的维生素D水溶液稳定的组合物加入到VD水溶液中，均能保持维生素D水溶液的稳定性，且实施例1～3的效果明显好于对比例1～3。

[0040]实验例2：质控品的稳定性实验
[0041]将实施例1～3以及对比例1～3制备的组合物添加不同浓度的VD溶液分别作为质控品1、2，然后光照3天进行检测，吸光度值结果如下表2所示。

[0042]表2
[0043]
[0044]由此可见，实施例1～3、对比例1～3的维生素D水溶液稳定的组合物加入到VD水溶液中，均能保持维生素D水溶液的稳定性，且实施例1～3的效果明显好于对比例1～3。