第二十章 高效液相色谱(0512)课件

四、检测器
检测器是液相色谱仪的三大关键部 件之一。对检测器的要求是，灵敏度高 、重复性好、线性范围宽、死体积小以 及对温度和流量的变化不敏感等。
检测器的分类
在液相色谱中，有两种类型的检测器 ，一类是溶质性检测器，它仅对被分离 组分的物理或物理化学特性有响应。属 于这类的检测器有紫外、荧光、电化学 检测器等。另一类是总体检测器，它对 试样和洗脱液总的物理或化学性质有响 应。属于这类的检测器有示差折光检测 器等。
输液泵
输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流 泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定 性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质 的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要 依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两 大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞 往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
直接紫外检测： 所使用的流动相为在检测 波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接 测定被测组分的紫外吸收强度。
间接紫外检测： 使用具有紫外吸收的溶液 作流动相，间接检测无紫外吸收的组分 。
柱后衍生化光度检测： 对于那些可以与显 色剂反应生成有色配合物的组分，可以 在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适 的显色剂反应，在可见光区检测生成的 有色配合物。
紫外-可见光检测器
原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分 对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组 分浓度成正比。
UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有 很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度 、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所 以还能用于梯度淋洗。
用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度 ，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检 测波长。
荧光检测器
原理： 许多有机化合物，特别是芳香族化 合物、生化物质，被一定强度和波长的紫外光 照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧 光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成 正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光， 但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。
特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏 度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样 品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的 分析。
分离原理
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流 动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用力，作用力的大 小，决定色谱过程的保留行为。
§20-2 高效液相色谱仪
高效 液相色谱 仪由高压 输液系统 、进样系 统、分离 系统、检 测系统、 记录系统 等五大部 分组成。
一、高压输液系统
高压输液系统由溶剂贮存器、高压 泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。
梯度洗脱操作
线性梯度： 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强 度。 阶梯梯度： 直接从某一低强度的流动相改变为另一较 高强度的流动相。
梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的 溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是 解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有 混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以 将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。
目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波 振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气
梯度洗脱装置
为什么要进行梯度洗脱？ 在进行多成分的复杂样品的分离时
，经常会碰到前面的一些成分分离不完 全，而后面的一些成分分离度太大，且 出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相 差很大的多种成分在合理的时间内全部 洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度 洗脱技术。
Байду номын сангаас
电导检测器（conductivity detector, CD） 原理： 基于离子性物质的溶液具有导电性
，其电导率与离子的性质和浓度相关。 电导检 测器是离子色谱中必备的检测器。
电导池是其核心。 电导池的结构： 检测体积可达到微升甚至纳升
级。基本结构是在柱流出液中放置两根电极， 然后通过适当的电子线路测量溶液的电导。
（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相 的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性 柱也称正相柱。
（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反 相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型 分离柱上的出峰顺序相反。
流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
2. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液 相色谱，其选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著 提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制 备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自 行制备。
选择短柱、细内径提高分析速度；
研制高效柱填料是一活跃领域。
液相色谱流动相
（1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。 （2）与固定相不互溶，而使柱效下降或损坏柱子。也不
脱气装置
流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气 泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰 。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或 色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致 使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很 费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气 体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。
1、溶剂贮存器 2、高压输液泵 3、梯度洗脱装置
输液泵
高压输液泵是液相色谱仪的关键部 件，其作用是将流动相以稳定的流速或 压力输送到色谱系统。对于带在线脱气 装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置 再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接 关系到分析结果的重复性和准确性。
. 对输液泵的基本要求
流量准确可调。流动相的流速在0.5-2mL/min，输 液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的 流量控制精度通常要求小于±0.5%。
§20-1 概述
一、高效液相色谱法 二、液相色谱分离原理及分类
高压液相色谱法
在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色 谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期， 将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用 到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特 别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不 断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。这 种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效 液相色谱法，也称高压液相色谱法或高速液相色谱法 。
示差折光检测器
原理：基于样品组分的折射率与流动相溶 剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起 流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的 浓度成正比。
绝大多数物质的折射率与流动相都有差异， 所以RI是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度 比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那 些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖 类、脂肪烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中 是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。
蒸发光散射检测器
基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加 热漂移管、激光光源和光检测器等部件构成。 因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关， 而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以 ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫 外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。 其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源 强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它 的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用 于梯度洗脱。
(2) 梯度淋洗装置
外梯度:
利用两台高压输液泵 ，将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱 。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
二、进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用 是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。液相色谱 的进样方式有两种。进样器：微量注射器和进样阀。
三、影响分离的因素
在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U 较小，可以忽略不计，而只有两项，即：
H=A+Cu 故高效液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同， 如图所示：
影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性 。
1. 影响分离的因素——流速
流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是 一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提 高不是很大。但在实际操作中，流量仍是 一个调整分离度和出峰时间的重要可选择 参数。
发生不可逆反应。 （3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效
（4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时 ，溶剂要不吸收紫外光。 （5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便 宜等。
3. 流动相及流动相的极性
（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相 色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋 洗液，洗脱剂。
进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样 时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相 色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好 和操作方便的六通阀进样器。
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等 部件。
色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高 、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填 料特性、填充质量和使用条件有关。
色谱填料： 经过制备处理后，用于填充色谱 柱的物质颗粒，通常是5-10微米粒径的球形颗 粒。
色谱柱管： 内部抛光的不锈钢管。典型的液 相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。
色谱柱： 也称固定相，是将色谱填料填充 到色谱柱管中所构成的,
填料的结构
色谱填料是由基质和功能层两部分构成。 基质： 又常称作载体或担体，通常制备成
§20-3 液固色谱法
液-固色谱的固定相是固体吸附剂。 吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，存 在一些分散的具有表面活性的吸附中心 。因此，液固色谱法是根据各组分在固 定相上的吸附能力的差异来进行分离的 ，故也称液固吸附色谱。
吸附色谱的分离机理
• 随着样品在固定 相上的吸附能力 由大到小
数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一 定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明 显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来 作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。
功能层： 是通过化学或物理的方法固定在 基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的 有机分子或功能团。填料的物理结构： 分为微 孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄 壳型和表面多孔型四种类型。
耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10um 粒径）的填料，在高压下填充到柱管中，为了 保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要 足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到 30-60MPa的高压。
液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动。
泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗 脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结 构材料应耐化学腐蚀。
二极管阵列检测器
以光电二极管阵列（作为检测元件的UV-VIS检 测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由 光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波 长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集 数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱 图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UVVIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长 的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测 器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通 过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器 上被检测。
第二十章 高效液相色谱
§20-1 §20-2 §20-3 §20-4 §20-5 §20-6 §20-7 §20-8
概述 高效液相色谱仪 液固色谱法 液液色谱法 化学键合相色谱法 离子交换色谱法 排阻色谱法 色谱分离方法的选择
导学
以色谱法导论和气相色谱法两章为基础 ，通过学习，掌握分离原理及分类，了解液 相色谱和气相色谱的异同，对高效液相色谱 仪的流程了解的前提下，注意梯度洗脱装置 ；对本章中提及的几种液相色谱法，应侧重 掌握其原理和其固定相及流动相的要求，主 要是化学键合相色谱法，而对“色谱分离方 法的选择”，是对P445的表进行理解。