HPLC测定复方熊胆胶囊中牛磺熊去氧胆酸的含量

HPLC测定复方熊胆胶囊中牛磺熊去氧胆酸的含量目的：鉴定并测定复方熊胆胶囊中人工熊胆的含量，以保证药品质量。

方
法：参考《中国药典》质量标准部分，采用HPLC鉴定并测定人工熊胆在每粒胶囊中的含量。

结果：HPLC实验结果显示，样品与牛磺熊去氧胆酸对照品在相同时间出现对应色谱峰；复方熊胆胶囊中人工熊胆含量不低于10 mg/粒。

结论：通过HPLC可以有效地鉴定复方熊胆胶囊中的人工熊胆，并且能精确地测定人工熊胆的含量。

标签：复方熊胆胶囊；牛磺熊去氧胆酸；定性鉴别；含量测定
复方熊胆胶囊是以人工熊胆、麝香、黄芪、乳香等为原药材制成的胶囊制剂，源于犀黄丸，具有镇静、解热、抗惊厥、抑菌、抗炎、抗过敏、镇咳、祛痰、平喘、助消化、去胆石、强心、降压及抗肿瘤作用。

由于复方制剂原料药较多，成分复杂，为保证复方制剂的质量，需对其主要成分进行鉴别并测定含量。

本文选取了复方熊胆胶囊中君药人工熊胆为例，探讨复方中主要成分的鉴别和含量测定方法，为保证复方制剂的质量提供科学的依据。

1 材料
电热恒温水浴锅（北京长安永创科学仪器有限公司），旋转蒸发仪（上海亚荣），Agilent 1100 高效液相色谱仪（在线脱气机、四元泵、自动进样器、VWD 检测器）；MILLIPORE Simplicity超纯水器超声波清洗器（型号SK5200H，功率150 W，频率20 kHz，上海科导仪器有限公司）。

试剂乙腈（色谱纯，Fisher chemical）。

牛磺熊去氧胆酸钠（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号0816-200004）。

2 方法与结果
2.1 人工熊胆的HPLC鉴别
2.1.1 色谱条件[1-2] Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流速1.1 mL·min-1。

根据相关文献及对照品和样品的全波长扫描结果选择204 nm为检测波长。

本实验检测以下流动相条件：①乙腈-2‰磷酸溶液（31∶69）；②乙腈-水（水相0.3%磷酸以三乙胺调pH至4）（29∶71）。

结果表明，牛磺熊去氧胆酸钠对照品在乙腈-水（水相0.3%磷酸以三乙胺调pH至4）（29∶71）流动相条件下与其他色谱峰达到基线分离。

2.1.2 供试品溶液的制备取本品0.5 g，精密称定，置三角瓶中，加无水乙醇45 mL，超声提取45 min，取出冷却，无水乙醇定容至50 mL，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备精密称取牛磺熊去氧胆酸钠适量，制成0.2 g·L-1的对照品溶液。

2.1.4 阴性对照品制备除熊胆外，称取1/1 000处方量的药材，按复方熊胆胶囊制备工艺制备成干浸膏，并按比例与淀粉混匀，按供试品溶液制备法制备。

2.1.5 HPLC检测取缺熊胆阴性对照溶液，精密吸取续滤液10 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1.1项下的色谱条件测定，记录色谱图，见图1。

由色谱图可知，阴性对照品对鉴别无干扰，供试品与对照品在相同时间出现色谱峰。

试验结果表明，HPLC可以准确鉴别复方熊胆胶囊中的人工熊胆成分。

2.2 HPLC测定人工熊胆含量
2.2.1 色谱条件同2.1.1项。

2.2.2 供试品溶液的制备称量4份样品各0.5 g，精密称定分别装于10 mL 量瓶中，加无水乙醇45 mL，依次采用回流提取，超声15，30，45 min提取，取出冷却，无水乙醇定容至50 mL，进行测定，提取率
图 1 牛磺熊去氧胆酸钠对照品（A）、复方熊胆胶囊样品（B）和阴性溶液（缺人工熊胆，C）的HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of tauroursodeoxycholic acid sodium salt （A），compound bile capsule （B）and negative solution（lack of artificial bile，C）
（峰面积/称样量）分别为1 618.6，1 647.5，1 886.0，1 891.1。

结果表明，超声45 min提取基本完全，故采用超声45 min试验，即取本品0.5 g，精密称定，置三角瓶中，加无水乙醇45 mL，超声提取45 min，取出冷却，无水乙醇定容至50 mL，即得。

2.2.3 线性关系考察精密称取牛磺熊去氧胆酸钠适量，制成0.24 g·L-1的对照品溶液，分别吸取6，8，10，16，23，25 μL，按色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。

以峰面积积分值为纵坐标，牛磺熊去氧胆酸钠的量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

线性方程为y=292.12x-38.445（r=0.999 9），结果表明牛磺熊去氧胆酸钠在1.45～6.00 μg呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验取对照品牛磺熊去氧胆酸钠2.4 mg，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取10 μL，连续进样6次，熊胆酸峰面积积分值RSD 2.1%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于配制后0，4，8，12，16，24 h依法测定，结果熊胆酸峰面积积分值RSD 1.1%，结果表明，供试品溶液在24 h 内稳定。

2.2.6 重复性试验分别称取同一批号样品6份，按照供试品溶液制备方法制备，采用上述色谱条件进行测定，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，记
录每份样品的峰面积，RSD 0.67%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 回收率试验采取加样回收法（按1∶1加入），取已知含量的同一批号样品，精密称定，0.150 51，0.150 80，0.160 12，0.150 60，0.157 90，0.158 91 g，分别精密加入牛磺熊去氧胆酸钠对照品溶液相当于2 mg牛磺熊去氧胆酸钠，加入25 mL量瓶中，加入无水乙醇超声45 min，以无水乙醇补足失重，过滤。

按色谱条件测定，结果见表1。

结果表明，加样回收率在99.55%～104.8%之间，回收率良好。

2.2.8 含量测定取3批样品，每批2份进行含量测定，按供试品溶液制备法配制样品溶液，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按色谱条件测定峰面积，通过线性标准曲线计算样品含量，结果见表2。

以上3批样品含量测定结果，含量介于27～29 mg·g-1。

根据部颁标准96规定熊胆粉中以牛磺熊去氧胆酸计不低于23.0%，每粒中含熊胆42 mg，现规定本品含牛磺熊去氧胆酸量不低于25 mg·g-1，即10 mg/粒。

表1 牛磺熊去氧胆酸钠的回收率试验
Table 1 The result of recovery test of tauroursodeoxycholic acid sodium salt
表2 牛磺熊去氧胆酸钠的含量测定
Table 2 The assay of tauroursodeoxycholic acid sodium salt
3 讨论
本实验采用HPLC鉴别了复方熊胆胶囊中的人工熊胆，操作简便，稳定性好，没有干扰，可以作为复方熊胆胶囊中人工熊胆的定性鉴别方法。

另外，本实验建立了用HPLC测定复方熊胆胶囊中人工熊胆含量的方法，测定过程中牛磺熊去氧胆酸与其他组分能够很好地分离，精密度、线性关系、重复性和回收率均符合测定要求，可作为复方熊胆胶囊中人工熊胆的质量控制方法。

[参考文献]
[1] 王英峰，魏小燕.HPLC测定枫香脂碱提物中脱氢松香酸和松香酸的含量[J].中国中药杂志，2013，38（1）：57.
[2] 崔九成，白吉庆，张恩林，等. 移植珠子参质量分析研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16（4）：44.
Determination of tauroursodeoxycholic acid in compound
bile capsule by HPLC
CHEN Fei，LONG Hai-lin，LEI Hai-min，LI Qiang
（1.Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；
2. Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；
3. School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）
[Abstract] Objective：To discriminate and determine of the artificial bear bile of the compound bile capsule. Method：Taking the pharmacopoeia as reference，the artificial bear bile was discriminated and determined by HPLC. Result：The compound bile capsule and the control sample had chromatographic peak at the same time from HPLC. The content of the artificial bear bile was above 10 mg per tablets. Conclusion：The artificial bear bile of compound bile capsules can be discriminated effectively and determined accurately by HPLC method.
[Key words] compound bile capsule；tauroursodeoxycholic acid；discrimination；assay
doi：10.4268/cjcmm20140516。