外标-气相色谱-质谱法准确测定猪肉中的14种脂肪酸

外标-气相色谱-质谱法准确测定猪肉中的14种脂肪酸
喻文娟;侯静文;朱邦尚
【摘要】采用外标-气相色谱-质谱法准确测定了猪肉中14种脂肪酸的含量和百分含量,并与峰面积归-化法的结果进行了比较,两种方法都测出猪肉中8种主要的脂
肪酸:肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、反油酸、油酸、亚麻酸、亚油酸.峰面积归-化法测定高含量脂肪酸结果较为准确,测定低含量脂肪酸则误差较大.同时对相关国标中的前处理方法进行了改进,脂肪提取用溶剂浸提法代替索氏提取法,脂肪酸甲酯化用碱常温催化酯交换法代替先皂化、再甲酯化的方法.方法学试验结果表明:14种脂肪酸甲酯的线性回归相关指数R2皆大于0.992、加标回收率皆大于75％、而样品平行测定3次的相对标准偏差RSD皆小于5％.该方法简便、环保、准确性好、精密度高,完全满足猪肉中脂肪酸的分析需要,可广泛应用于猪肉等肉类样品中脂肪酸的日常检测工作.%The contents and percent contents of fourteen fatty acids in pork has been accurately determined by external standard-gas chromatography-mass spectrometry and compared with the percent contents determined using peak area normalization method. Both methods have shown that the eight primary components in pork are myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, elaidic acid, oleic acid, linolenic acid and linoleic acid. As for nomalisation method, the results of high-content fatty acids were more accurate, while those of low-content fatty acids produced some errors. Meanwhile, the sample preparation procedures in relevant Chinese Standards have been improved. Soxhlet extraction was replaced by solvent extraction to obtain fats the two-step method of saponification before methyl esterification was
replaced by the one-step method of ester exchanging reaction catalyzed by base at room temperature to obtain fatty acid methyl ester (FAME). The methodological study showed that for all the fourteen fatty acids, Rz of linear regression were above 0. 992, the recoveries were above 75%, the relative standard deviations (RSDs) of three parallel sample determinations were below 5%. With its simplicity and environmentally-friendliness, the accuracy and precision of the method have ail met the requirements of daily analysis of fatty acids in pork.
【期刊名称】《分析仪器》
【年(卷),期】2012(000)003
【总页数】7页(P10-16)
【关键词】气相色谱法;质谱法;外标法;猪肉;脂肪酸
【作者】喻文娟;侯静文;朱邦尚
【作者单位】上海交通大学分析测试中心,上海200240;上海交通大学分析测试中心,上海200240;上海交通大学分析测试中心,上海200240
【正文语种】中文
1 引言
研究猪肉脂肪酸组成及含量，对改善肉食香味、提高猪肉的食用价值以及生产有利于人体健康的肉产品均具有重要意义[1]。

猪肉中的脂肪酸主要储存于脂肪中，即甘油三酯。

目前肉及肉制品中脂肪酸的测定可参考的国标主要有GB/T 9695.2-
2008[2]和GB/T 22223-2008[3]，两者都是将脂肪提取出来后先皂化再甲酯化，
步骤较繁琐，且高温加热，可能会导致脂肪酸不饱和双键的迁移[4]。

本文在参考
众多文献[5-7]的基础上，采用碱常温催化酯交换法对脂肪酸进行甲酯化，更简便，而且避免了双键转移所产生的油脂异构化。

脂肪的提取则用简便的溶剂浸提法取代国标[2，3]中繁琐的的索氏提取法和酸水解法。

目前对于各类样品中脂肪酸成分的分析，大都采用峰面积归一化法定量，这个方法其实只是一种半定量，与实际含量有一定差别。

本文同时用准确、权威的外标法和峰面积归一化法测定了样品中的14种脂肪酸含量，并进行了对比，以评价峰面积归一化法的准确性。

同时进行了线性、回收率与精密度的方法学考察，试验结果表明，本方法不仅简便、环保、且准确、精度高，可应用于猪肉中脂肪酸的日常分析。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
仪器：AutoSystem XL气相色谱仪/TurboMass质谱仪(美国Perkin Elmer公司)；旋涡混合器；超纯水机；鼓风干燥箱。

试剂：19种脂肪酸甲酯的混合标准品(C8-C22)；苯、石油醚(沸程30～60℃)、氢氧化钾、甲醇、正己烷、无水硫酸钠均为分析纯；水为超纯水。

样品：猪后腿肉购自上海某菜场，当场用绞肉机两次绞碎，零下20℃冰箱冷冻保存。

2.2 溶液配制
苯-石油醚(1 ︰1)混合溶剂：苯与石油醚按体积比1 ︰1混合。

氢氧化钾-甲醇溶液(0.4mol/L)：称取2.24g氢氧化钾，溶解于100mL甲醇。

脂肪酸甲酯混合标准储备液：准确称取100.0mg脂肪酸甲酯混标，全部转入
10mL容量瓶中，正己烷定容至刻度，得总脂肪酸甲酯含量为10.0mg/mL的混合标准储备液。

2.3 样品处理
脂肪提取：将10g肉样从冰箱中取出解冻，置于培养皿中，于103℃干燥1h，取出研碎后称取约0. 5g干样，置于10mL玻璃离心管中，加入2mL苯-石油醚(1︰1)混合溶剂，密闭浸提24h。

快速甲酯化：浸提24h后再向其中加入2mL氢氧化钾-甲醇溶液(0.4mol/L)，漩
涡混合器上震荡3min，静置30min。

加入超纯水分层，取上层溶液，加入一定量无水硫酸钠，备用。

取100μL待测样品，加1mL己烷稀释后进样。

2.4 GC-MS条件
色谱柱：DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；进样温度：260℃；进样量：1μL；分流比：10︰1；载气：氦气(99.999%)；流量：1mL/m in；柱温：70℃保
持4min，以10℃/min升至200℃，再以5℃/min升至300℃，保持8min；接口温度：260℃；离子源温度：200℃；电离方式：EI+，70ev；光电倍增管电压：450V；扫描方式：全扫描；质量范围：33～500；溶剂延迟4min；NIST98谱库。

3 结果与讨论
3.1 分离效果
图1为19种脂肪酸甲酯的色谱图。

由图可知，19种脂肪酸甲酯分离良好，15种组分实现了完全基线分离，但油酸甲酯与亚麻酸甲酯经质谱确认为共流出，亚油酸甲酯以及反油酸甲酯都与油酸甲酯/
亚麻酸甲酯实现了基本基线分离。

脂肪酸甲酯的出峰顺序有如下规律：碳链越长出峰越晚。

不饱和脂肪酸甲酯比相应的饱和脂肪酸甲酯早出峰，这与吴惠勤等[8]的
结论刚好相反，这是由于使用不同的毛细分离柱所导致。

本文中所使用的毛细管柱是非极性柱DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm)，而文献[8]中的毛细管柱是强极
性柱HP-88 (100m×0.25mm×0.2μm)。

3.2 线性范围与回归方程
分别取100μL、250μL、400μL、500μL、750μL、1000μL、1500μL、3000μL
的混合标准储备液置于5mL容量瓶中，加正己烷定容，制成一系列浓度的混合标
准溶液，依次进样、记录峰面积，以峰面积对浓度进行一元线性回归。

因样品各组
分含量差异较大，故每个组分各自选取合适的浓度范围绘制标准曲线，十四种脂肪
酸甲酯的线性关系良好，相关指数R2皆大于0.99，各组分的结构、在混标中的质
量百分数、方法的线性范围、回归方程、相关指数R2见表1。

3.3 回收率与精密度
平行称取3份1#猪肉样品(其脂肪酸含量见表3的第2列)，质量依次为0.5022、
0.4987、0.5043g，同样添加100mg脂肪酸甲酯的混合标准品，考察方法的回收
率与精密度(表2)。

由表2可见，14种脂肪酸甲酯的加标回收率皆大于75%，相
对标准偏差RSD皆小于10%。

图 1 十九种脂肪酸甲酯的色谱图
表 1 各组分的结构、质量百分数、线性范围、回归方程、相关指数R2
* 由于样品中另外五种脂肪酸甲酯含量过低或未检出，所以没有进行定量。

** 十五酸甲酯提取特征离子74进行积分，油酸甲酯提取特征离子296进行积分，
亚麻酸甲酯提取特征离子292进行积分。

表 2 14种脂肪酸甲酯的回收率、精密度(n=3)
续表 2
3.4 样品测试
利用外标法对本市某菜场不同摊位销售的3份猪后腿肉中的14种脂肪酸的含量及
相对含量进行了测定，每个样品平行测定3次，14种脂肪酸含量的RSD均小于
5%，取平均值列入表3，同时也将峰面积归一化法的结果见表3。

表 3 不同猪肉样品中十四种脂肪酸的含量、百分含量和峰面积百分含量 (n=3) (mg/g, %)
* 由于油酸甲酯和亚麻酸甲酯的色谱峰共流出，故只能将它们的峰面积合并计算。

** 实际测得的含量是每个样品中脂肪酸甲酯的含量，但因脂肪酸甲酯与脂肪酸的
分子量相差不多，故用来近似表示样品中脂肪酸的含量。

外标法与峰面积归一化法都能测出猪肉中8种主要的脂肪酸(含量大于1%)：肉豆
蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、反油酸、油酸、亚麻酸、亚油酸；而joo等[9]、宋凡[6]和刘培琼等[10]测得的猪肉中的主要脂肪酸都不包含反油酸。

怀疑这
与色谱柱的分离能力以及不同的仪器有关：本文采用的是一根较新的弱极性毛细管柱DB-5MS，而joo等和宋凡采用的都是极性相对较强的毛细管柱，刘培琼等采
用的是填充柱(其分离效果一般不如毛细管柱)；GC-MS可通过标准品和质谱两种
手段对样品进行定性，GC则只能靠标准品定性。

此外，猪不同部位的肉其脂肪酸分布也有差异。

通过比较发现，脂肪酸的含量越小，外标法和峰面积归一化法的结果相对误差越大；脂肪酸的含量越大，两者的相对误差越小。

以外标法的结果作参照，峰面积归一化法对于测定高含量脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸，其结果较为准确；如测定低含量脂肪酸如癸酸、月桂酸、十五酸、十七酸、花生酸和顺-11-二十烯酸等，则误差较大。

此外，由样品的代表色谱图图2可见，主要的组分全部都是脂肪酸甲酯，可见前
处理成功的将脂肪提取出来、成功的进行了脂肪酸的甲酯化、并去除了众多干扰组分。

由表3还可见，三个摊位销售的猪后腿肉的脂肪酸总量差别不大，都在
0.3g/g左右；大部分脂肪酸的百分含量差别也不大。

图 2 样品色谱图
4 结论
本文中脂肪的提取采用简易的溶剂浸提法，取代了国标GB/T 9695.2-2008和众
多文献中使用的索氏提取法，更为简便、环保，且回收率试验表明提取效果很好。

因为猪肉中的脂肪酸基本储存于脂肪中，故如何进行甲酯化以获得游离的脂肪酸是关键。

范亚苇等[4]详细研究了不同甲酯化方法适用的对象，发现游离脂肪酸的甲
酯化采用三甲基硅重氮甲烷(TMS)催化法效果比较好；而甘油三酯采用碱催化法效果较好, 甲酯化程度高；游离型和甘油三酯型的脂肪酸都可以用酸催化法甲酯化,
但甲酯化的程度比前两种方法低。

Sassano等[11]和寇秀颖等[12]也有类似结论。

本研究中猪肉的甘油三酯应用碱常温催化法，脂肪酸通过酯交换直接从甘油三酯变成甲酯，无需再进行甘油脂的皂化和游离脂肪酸的酯化。

该方法不仅甲酯化效率高，且反应快速、简单，而且常温反应，避免了双键转移所产生的油脂异构化，使测试结果能真实的反映脂肪酸组成。

由于油酸甲酯和亚麻酸甲酯在TIC上共流出，即完全没分开，如果采用单纯的气
相色谱法，无法对这两种重要的脂肪酸进行单独定量；而利用质谱法可对单个碎片离子进行定量的优点，分别提取它们的特征离子进行积分和定量，使得两个色谱未分开的组分也得到了准确的定量。

此外，通过绘制标准曲线，对14种脂肪酸甲酯都进行了准确定量，并以此为参照，对于目前脂肪酸定量的主流方法峰面积归一化法进行了评价。

峰面积归一化法测定高含量脂肪酸结果较为准确，测定低含量脂肪酸则误差较大。

样品谱图表明，该前处理方法较成功，主要的组分全部都是脂肪酸甲酯，而回收率试验表明该方法的提取效率可达75%以上。

同时，通过方法学的考察，证明该方
法线性良好、准确性好、精密度高，14种脂肪酸甲酯的线性回归相关指数R2都
大于0.992、加标回收率皆大于75%、而样品平行测定3次的相对标准偏差RSD
皆小于5%，完全满足方法分析的要求, 非常适合猪肉等肉类样品中脂肪酸的日常
检测工作。

本试验由于使用的是固定浓度的混标，其脂肪酸百分含量与实际样品有一些差异，并非所有组分的标准曲线都能完全包含样品(尤其是加标样品)中的浓度，这给定量造成一定的误差。

经质谱定性，样品中还含有一定量的花生四烯酸(其含
量略低于顺-11-二十烯酸)及其他低含量的脂肪酸，但为了对两种定量方法进行比较，没有将其一一列出。

参考文献
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