固相萃取液相色谱串联质谱法检测尿中双酚类和卤代双酚类物质

固相萃取液相色谱串联质谱法检测尿中双酚类和卤代双酚类物
质
胡小键;张海婧;王肖红;丁昌明;金银龙;林少彬
【摘要】建立了高效液相色谱串联质谱法同时检测人尿液中4种双酚类和卤代双酚类物质的方法。

尿液样品经酶解后,采用PLEXA(亲水亲脂聚合物小柱)固相萃取柱净化,在Atlantis® T3柱(150 mm ×3.0 mm,3μm)上,以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,流速250μL/min,串联质谱负离子电喷雾多反应监测模式检测,基质匹配内标法定量分析。

结果表明,4种物质平均回收率为86%~118.0%,日内精密度为
2.6%~17.0%,日间精密度
3.2%~18%,检出限为0.01~0.25μg/L。

应用本方法测定200份人尿液样品,双酚A检出率为75%,检出浓度在0.58~50.5μg/L之间。

本方法操作简单、灵敏、快速、可靠。

%A method was developed for the determination of four kinds of bisphenolic and halogenated bisphenolic compounds including bisphenol F, bisphenol A, tetrachlorobisphenol A, tetrabromobisphenol A in human urine using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The analytes was extracted by solid phase extraction. The separation of the analytes was achieved on an Atlantis T3 column (3. 0×150 mm, 3 μm) gradient eluted with the mobile phase of acetonitrile and water at the rate of 250 μL/min, and detected by an electrospray ionization tandem mass spectrometry in the multiple-reaction-monitoring negative mode. The quantification was carried out by matrix-matched calibration curve. The average recoveries at 3 spiked levels were 86%-118%, with intra-day precision of 2 . 6%-17 . 0% and inter-day precision of 3. 2%-18. 0%. The limits of detection of four
analytes (S/N=3) were 0. 01-0. 25 μg/L. The method was applied to the analysis of 200 human urines samples and the results showed that the method was simple, sensitive and reliable.
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2014(000)007
【总页数】4页(P1053-1056)
【关键词】双酚类物质;卤代双酚类物质;尿液;固相萃取;高效液相色谱串联质谱
【作者】胡小键;张海婧;王肖红;丁昌明;金银龙;林少彬
【作者单位】中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京100021;
中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京100021;中国疾病预防
控制中心环境与健康相关产品安全所，北京100021;中国疾病预防控制中心环境
与健康相关产品安全所，北京100021;中国疾病预防控制中心环境与健康相关产
品安全所，北京100021;中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北
京100021
【正文语种】中文
1 引言
双酚类及卤代双酚类物质主要包括双酚F(Bisphenol F，BPF)、双酚A(Bisphenol A，BPA)、四氯双酚A(Tetrachlorobisphenol A，TCBPA)和四溴双酚
A(Tetrabromobisphenol A，TBBPA)等。

BPF和BPA是一种重要的化工原料，
主要用于生产环氧树脂、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯等材料，也用于酚醛树酯、杀菌剂、
抗氧化剂、聚氯乙烯等化工产品中作稳定剂。

TCBPA和TBBPA在工业上常被用作阻燃剂，用于印刷线路板的阻燃以及ABS，HIPS等多种材料的阻燃。

这些塑料制品在使用过程中，其中的BPF，BPA，TCBPA和TBBPA会释放到环境中，通过水、食物、大气等途径进入人体，产生危害。

BPF，BPA，TCBPA和TBBPA被证实具有雌激素作用，干扰内分泌系统［1］。

最近研究发现，BPA，TCBPA，TBBPA能激活体内肥胖基因，导致肥胖［2］。

进入体内的双酚类物质，以单体或聚合物形式从尿中排出体外，因而测定尿中双酚类物质的含量，有助于了解双酚类物质在人体的内暴露水平。

目前，测定双酚类和卤代双酚类物质的方法主要有高效液相色谱法［3，4］、气相色谱质谱联用法［5～7］、液相色谱质谱联用法［8～10］。

这些方法主要集中于环境样品。

文献［11］采用在线固相萃取液相色谱串联质谱法测定尿中的游离态和结合态的双酚A，检出限为0.3μg/L。

文献［12］采用直接进样液相色谱串联质谱法测定鼠尿中TBBPA的含量，方法简单快速，检出限为2.5μg/L。

本实验通过优化固相萃取前处理技术，利用液相色谱串联质谱仪同时测定尿中4种双酚类和卤代双酚类物质。

应用本方法测定了200份人尿液中4种物质的含量。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)串联API4000三重四级杆质谱仪(美国Applied Biosystems公司)。

数据采集由Analyst 1.5.1软件(美国Applied Biosystems公司)完成。

24位固相萃取装置(美国Supelco公司);瓦里安Bond Elute Plexa(60 mg/3 mL，美国Agilent公司);Milli-Q Gradient超纯水仪(美国密里博公司);N-EVAP氮吹仪12位(美国Organomation公司)
BPF，BPA，TCBPA，TBBPA，BPA-d16(纯度＞97%，美国Sigma公
司);TBBPA-d10(100 mg/L，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司);β-葡萄糖苷酸酶
/硫酸酯酶(β-葡萄糖苷酸酶4.5 U/mL，硫酸酯酶14 U/mL，德国Roche公司);甲醇、乙腈(HPLC级，美国Fisher公司);乙酸、乙酸铵(分析纯，国药集团)。

2.2 溶液的配制
乙酸铵缓冲溶液配制:取7.71 g乙酸铵，加入94 mL纯水，加入6 mL乙酸，调成pH5.0的缓冲溶液。

标准品储备液:分别准确称取 BPF，BPA，TCBPA，TBBPA，BPA-d16适量，用甲醇溶解，配成100 mg/L标准储备液，于4℃保存。

混合标
准工作液:分别准确移取适量各标准品储备液于同一量瓶中，加乙腈-水(1∶1，V/V)稀释，制成所需浓度的混合标准工作液。

混合内标的配制方法相同。

2.3 色谱条件
Waters Atlantis® T3色谱柱(150 mm×3.0 mm，3 μm);柱温为室温;进样量为
10μL;流速:250μL/min;流动相:乙腈(A)和水(B)，梯度洗脱(0 ～5 min，50% ～100%A;5 ～9 min，100%A;9～10 min，100% ～50%A;10～15 min，50%A)。

2.4 质谱条件
电喷雾电离源，负电离模式，多反应监测(MRM);高纯氮气，碰撞气(CAD)压力为
7 psi，气帘气(CUR)为15 psi，雾化气(GS1)为40 psi，辅助气(GS2)为45 psi，
喷雾电压(IS)为-4500 V;去溶剂温度(TEM):400℃;扫描时间:100 ms。

4种物质及
内标的离子对、碰撞电压和去簇电压见表1。

表1 4种物质及内标的质谱参数Table 1 MS conditions for detection of 4 analytes*定量离子对(Quantitative ion pair)。

分析物Analyte离子对Ion
pair(m/z)碰撞气能量Collision energy(eV)去簇电压Declustering
potential(eV)Bisphenol F，BPF 199/93*/105 -16 -72 Bisphenol A，BPA
227/212*/133 -26 -90 Tetraohlorobisphenol A，TCBPA 365/286*/250 -45 -90 Tetrabromobisphenol A，TBBPA 543/448*/420 -50 -90 BPA-d16
241/142*/223 -35 -85 TBBPA-d10 553/298*/427 -50 -90
2.5 样品前处理
取冰冻尿样于室温下缓慢解冻，移取2 mL于10 mL玻璃比色管中，加入50μL 同位素内标(1 mg/L)，振荡;加入100μL酶，2 mL乙酸铵，振荡1 min。

于37℃水浴条件下水解12 h，取出，冷却至室温。

依次用3 mL甲醇，3 mL纯水，3 mL乙酸铵缓冲溶液活化固相萃取柱，随后转移样品至柱上，在自然重力下过柱，流速0.5 mL/min，样品管采用1 mL纯水振荡后转移至柱上。

样品流干后，加入3 mL 25%乙腈-水淋洗，空气吹干20 min，加入5 mL甲醇溶液，在自然重力下缓慢洗脱(0.5 mL/min)，收集洗脱液，于40℃ N2吹至近干，加1 mL乙腈-水(1∶1，V/V)，待测。

3 结果与讨论
3.1 色谱条件优化
比较了反相C18色谱柱和T3色谱柱对4种双酚A类物质的分离效果。

采用的两种类型的色谱柱对4种物质都具有较好分离效果，但C18柱对TBBPA保留性较强，在本实验条件下完全洗脱需要30 min，导致色谱分离时间过长。

而T3柱对4种物质的保留性较适中，在13 min内即能对4种物质形成较好的分离，且4种物质峰高和峰形均优于C18色谱柱。

实验还比较了两种型号的T3色谱柱(150 mm×3.0 mm，3 μm和150 mm×2.1 mm，3 μm)对4种物质的分离效果。

采用细内径色谱柱时，BPF保留时间较短，在3 min左右出峰，在实际尿样测定时会受到尿样基体物质干扰，调节流动相初始比例也不能改变状况。

采用粗内径色谱柱时，BPF保留时间较长，在5 min左右出峰，能与尿样基体干扰物质完全分离(图1)。

因此，本实验选择T3柱(150 mm×3.0 mm，3 μm)进行分析。

考察了甲醇-水和乙腈-水两种流动相配比对4种物质色谱行为的影响。

结果表明，当使用乙腈-水为流动相时，分析物色谱峰响应值较高，因此本实验选用乙腈-水为流动相。

3.2 固相萃取柱的选择
比较了3种固相萃取小柱C18柱和CARB柱(Supelco公司)、PLEXA柱对4种物质萃取效果。

实验表明，C18柱对TCBPA和TBBPA回收率为80% ～90%，但
对 BPF和 BPA回收率仅为50% ～60%。

CARB柱对尿液中4种双酚类物质均有
较好的富集效果，但回收率在100% ～200%之间，可能是由于CARB柱吸附性较强，能吸附一些极性化合物;在电离时，洗脱下来的极性化合物对4种双酚类物有
基质增强的作用。

使用PLEXA柱对4种物质进行固相萃取，回收率在80% ～120%，回收效果好。

HLB柱与PLEXA柱具有相同的填充材料，但由于PLEXA柱价格较低，所以实验选择PLEXA柱作为前处理柱。

图1 空白尿样加标(5μg/L)色谱图Fig.1 Chromatogram of blank urine spiked with standard(5μg/L)BPF:5.31 min;BPA:6.61 min;TCBPA:9.79
min;TBBPA:10.45 min.
3.3 淋洗溶液的选择
尿样基体较为复杂，固相萃取无淋洗过程会导致严重的基体干扰，导致定性与定量分析出现错误。

实验中加入淋洗步骤有助于样品的净化，但是淋洗液选择不当又容易导致目标物损失。

为实现最大的净化效果，同时又将分析物损失降到最低，考察了不同的淋洗液(甲醇-水和乙腈-水)及配比对4种物质回收率的影响。

结果表明，乙腈-水的淋洗效果效好，4种物质，尤其是BPF和BPA，损失较少。

采用甲醇-
水淋洗易洗脱下少量 BPF，导致回收率下降。

配制10%，15%，20%，25%，30%，40%，50%(V/V)的乙腈-水溶液进行淋洗效果的比较，结果表明，使用25%乙腈-水淋洗获得较好了淋洗效果，洗脱液基体干扰较少，BPF和BPA回收率最高。

3.4 线性范围和检出限
向空白尿样中加入系列混合标准溶液和内标溶液，在优化的实验条件下测定。

其中，BPF和BPA以BPA-d16为内标，TCBPA和TBBPA以TBBPA-d10为内标，进
行定量计算。

根据标准工作曲线测定结果，以浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。

以3倍信噪比(S/N)确定化合物定性检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N)确定定量检出限(LOQ)。

线性方程和检出限结果见表2。

表2 4种物质的线性方程和检出限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients，limits of dection of 4 analytes分析物Analyte内标Internal standard线性方程Regression equation线性范围Linear range(μg/L)相关系数Correlation
coefficient(r)LOD(μg/L)LOQ(μg/L)BPF BPA-d16 Y=0.00248X+0.00104 0.5 ～100 0.9984 0.21 1.06 BPA BPA-d16 Y=0.00702X－0.00411 0.5 ～100 0.9992 0.25 0.83 TCBPA TBBPA-d10 Y=0.712X+0.515 0.5 ～100 0.9995 0.01 0.03 TBBPA TBBPA-d10 Y=0.0155X+0.0434 0.5 ～100 0.9996 0.14 0.34
3.5 精密度和准确度
取空白尿样进行加标回收和精密度实验。

样品添加浓度分别为2.5，25和50μg/L。

每个添加水平样品平行测定5次，计算回收率和日内精密度。

平行测定3天，计
算日间精密度。

结果表明(表3)，在不同的添加水平下，平均回收率为86% ～118%，日内精密度为2.6% ～17.0%，日间精密度3.2% ～18.0%。

表3 方法的日内精密度、日间精密度和平均回收率Table 3 Intra-day precision，inter-day precision and average recoveries of the method分析物Analyte本底值Background value日内精密度Intra-day precision 日间精密度Inter-day precision(%，n=3)回收率Recoveries(R±SD，%)2.5μg/L 25μg/L 50μg/L
2.5μg/L 25μg/L 50μg/L 2.5μg/L 25μg/L 50μg/L BPF ＜LOD 85.7±12
92.9±6.0 91.1±6.4 14.7 6.4 7.0 18.0 9.5 13.4 BPA ＜LOD 118±3.0 92.9±3.4 86.6±3.6 2.6 3.6 4.2 12.3 3.2 12.6 TCBPA ＜LOD 114±16 104±6.2 97.2±5.2 16.9 5.1 5.3 13.2 3.7 16.2 TBBPA ＜LOD 94.2±18 96.3±5.9 86.4±5.8 17 6.2
6.7 1
7.5 9.7
8.9
3.6 实际样品测定
应用本方法测定200份尿样，BPA检出率为75%，检出浓度在0.58～50.5μg/L
之间，其它3种物质均未有检出，提示BPA在人体的污染较为广泛。

以上结果表明，方法快速简便、灵敏度高、重现性好、适用于人体尿中双酚类和卤代双酚类物质的测定。

References
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