新西兰红鹿鹿茸多肽的纯化及活性研究

新西兰红鹿鹿茸多肽的纯化及活性研究
王少军
论文摘要
本文作者通过酸水提醇沉法结合现代生物化学技术，从头西兰红鹿鹿茸中提掏出多肽类成份；利用sephadex G-50凝胶过滤层析、反相高效液相色谱层析等作为分离、纯化手腕，取得纯度较高的鹿茸多肽；以体外表皮细胞培育技术和3H-TdR掺入法对其生物活性进行探讨，初步证明该成份具有必然增进大鼠乳鼠表皮细胞增殖作用。

关键词：新西兰红鹿鹿茸多肽纯化活性
鹿茸是鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或马鹿（C．elaphus L．）雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。

作为一种传统名贵中药，迄今已有二千连年的应用历史。

《神农本草经》中记载鹿茸“味甘，性温，主漏下恶血，寒热惊痫，益气强志，生齿不老”。

现代药理研究说明，鹿茸具有提高机体免疫力，强化学习和经历、增进性功能、强心、降压、抗氧化、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎症等作用（1）。

人们在养鹿进程中发现，鹿茸的生长异样迅速，可达2~3cm/d。

基于这一生物学特性，有人推测鹿茸中可能存在增进骨和上皮细胞快速生长的生物活性物质，而且，这种物质应该是鹿茸所特有的。

但是长期以来，一直未能找到这种活性成份。

已发觉的氨基酸、多胺、核酸、酯类、性激素、芳香性类化合物都不能充分说明鹿茸的这种生理活性。

最近几年来，人们将研究的重点转移到鹿茸中多肽类成份上，并已取得了冲破性的进展。

江润祥（2）等报导，从梅花鹿的鹿茸表皮层中分离出表皮生长因子（EGF），能明显增进表皮层的增殖，说明了鹿茸表皮既是EGF的合成组织，同时也是EGF的靶组织。

霍玉书（3）等从梅花鹿冻干鲜茸中，取得分子量在一万以上的多肽类物质，应用细胞调控因子活性的测定方式，发觉该物质具有神经生长因子（NGFS）样作用。

新西兰学者利用逆转录多聚酶链反映（R T—PCR）技术证明，在鹿茸顶部非骨化部位至少存在四种骨生长因子的mRNA，这些生长因子可能是鹿茸特有的生物活性物质。

最近，王本祥教授从梅花鹿茸中分离出具有很强的增进骨和软骨细胞和上皮细胞增殖的低分子量活性多肽——鹿茸生长因子，而且依照这一功效开发出国家二类新药鹿茸生长素。

上述研究说明，鹿茸多肽是一个天然的细胞生长因子群，它们是支持鹿茸快速生长的生物化学基础。

新西兰红鹿（Cervus elaphus Scoticus）系中国马鹿的一个亚种，其成品性状和化学成份与我国生产的马鹿茸大体一致（4）。

在长春中医学院新药研究中心刘永强教师的指导和参与下，咱们对新西兰红鹿鹿茸多肽进行了提取、分离和纯化，并对其生物活性做了初步的探讨。

实验材料
1药品与试剂
鹿茸为新西兰红鹿的三岔带血鲜茸，由新西兰提供，无菌锯茸后，用干冰速冻保鲜，送至本实验室备用。

流动相：异丙醇（北京化工厂，批号：980804），三氟乙酸（瑞典，批号：131198），超纯水由本实验室提供。

Dispase酶和胰蛋白酶均由Difco公司提供。

3H—TdR试剂由中国科学院原子能研究所同位素所提供。

PBS及D—Hanks缓冲液由本实验室配制。

1640培育液配制：10.4g1640（美国Sigma公司），加去离子水950ml，搅拌10min，加入碳酸氢钠2.0g，青、链霉素各1ml（10万u/ml），用HC1或NaOH 调~，超纯水配成1000ml，湿热灭菌。

以上化学试剂均为分析醇。

2 实验动物Wistar种大白鼠诞生24hr之内的乳鼠，购自吉林省药检所动物室，合格证号：2
3 要紧仪器
LC—8A高效液相色谱仪（日本岛津公司）
FD3冷冻干燥机（丹麦）
J—25高速冷冻离心机（美国Beckman公司）
JMS—80胶体磨（廊坊通用机械厂）
二氧化碳孵箱（美国REVCO公司）
超滤器，纯水器（美国Millipore公司）
倒置显微镜（日本）
LS—9800液体闪烁谱仪（美国Beckman公司）
实验方式
1提取
取鲜鹿茸0.45kg，切成1cm3小块，用4℃蒸馏水冲洗至无血色，粉碎，胶体磨匀浆，加入5000ml冰醋酸水溶液，4℃下浸泡3hr；匀浆液离心（8000rpm,20min），取上清液，加入95%乙醇至必然浓度，静置2hr；离心，取上清液，50℃水浴中旋转蒸发还收乙醇，过滤，滤液用3KD膜超滤，冻干，最后得A（分子量大于3000）和B（分子量小于3000）两个组分。

2 分离、纯化
Sephadex G—50凝胶过滤层析
取分子量大于3KD部份粗提物1g，上G—50凝胶柱（26×100cm；预先以，L 甲酸——甲酸铵缓冲液平稳），以平稳缓冲液洗脱，流速为1ml/min；搜集并测定各峰蛋白质浓度及活性，活性峰冻干。

反相高效液相色谱层析
2.2.1 色谱条件
流动相：异丙醇（以μm微孔滤膜过滤），‰三氟乙酸水溶液（自配）；固定相：JUPITER C5色谱柱（250×10mm）；流速：3ml/min；洗脱方式：梯度洗脱；进样量：40μl/次，柱温：室温；检测波长：280nm。

2.2.2 配制样品溶液
取上述冻干样品0.31g，溶于流动相，配成2ml溶液，以μm微孔滤膜过滤。

2.2.3 梯度洗脱
依图1设置梯度洗脱程序，搜集各峰洗脱液，回收异丙醇，冻干。

图1 梯度洗脱图
3 活性测定
乳鼠表皮细胞的分离培育
掏诞生24hr之内的大鼠乳鼠2-3只，冰上制动约20min，无菌条件下剥取背部皮肤，用PBS或D-Hanks液冲洗2次，加入Dispase酶，4℃左右放置20hr；用镊子轻轻将表皮与真皮剥离，取表皮加入%胰蛋白酶，37℃水浴约30min。

将表皮细胞移入1640培育液中，用吸管轻轻吹打，使表皮细胞游离至培育液中，弃去表皮碎片，离心，取沉淀，加入适量培育液，调至必然的细胞浓度。

取96孔培育板，每孔加入100μl细胞悬液，置于37℃二氧化碳孵箱中培育24hr以上。

3.2鹿茸多肽促表皮细胞增殖实验
取分离所提的6个鹿茸多肽样品，用生理盐水配成ml、ml两个浓度的样品溶液，μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

掏出培育板，镜下观看细胞生长状态良好，向培育液中加入样品，每孔10μl，每一个浓度重复四次，其中包括生理盐水对照组。

加样后，继续向每孔中加入80μl培育液，置于37℃二氧化碳孵箱中培育。

3H-TdR掺入法测定鹿茸多肽活性
细胞加样后培育至45hr掏出，每孔加入稀释后的3H-TdR（100μci/ml）10μl，放入孵箱继续培育3hr，掏出，吸去培育液，加入%胰蛋白酶和10%三氯醋酸（TCA）水溶液80μl，4℃冰箱中留宿；第二天用玻璃纤维滤膜过滤，并以5%三氯醋酸冲洗；滤膜干燥后，按圆形印痕剪下，放入装有4ml闪烁液的闪烁瓶中，Beckman LS—9800液闪系统测定每瓶CPm值。

4统计学处置
实验结果以X±S表示，各给药组别离与对照组比较，采纳t查验。

实验结果
1Sephades G-50凝胶过滤
如图2所示，鹿茸多肽粗提物上Sephadex G-50凝胶柱后，共洗脱出四个峰，搜集，冻干，得红Ⅰ～红Ⅳ：红Ⅰ重0.06g，红Ⅱ0.40g，红Ⅲ0.31g，红Ⅳ0.04g。

经细胞培育活性测定，红Ⅲ有活性。

图2 鹿茸多肽在Sephadex G-50柱上层析图谱
2反相高效液相色谱层析
结果如图3所示，洗脱液共分成六个组分。

其中，Ⅱ号峰为单一峰，样品纯度最高，其余组分均为混合峰，纯度较低，有待于进一步纯化。

图3 鹿茸多肽高效液相层析图谱
3鹿茸多肽对乳鼠表皮细胞增殖的阻碍
表1结果说明，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ号样品均能不同程度地增进乳鼠表皮细胞DNA合成和增殖，但其活性与浓度之间并无明显相关性。

浓度1： mg/ml,浓度2： mg/ml
与对照组比较：*,p<；**,p<；***,p<
讨论
1本实验在提取鹿茸多肽的进程中，除回收乙醇需50℃水浴外，其余步骤均在4℃条件下进行。

这在专门大程度上保留了蛋白质及肽类的活性，而多数报告中所用的鹿茸为热加工饮片的提取物（包括醇及其它有机溶媒提取），使大部份肽类失活（5）。

在醇沉操作中，乙醇的最终浓度是关键，浓度太低不易使大分子沉淀，浓度太高那么容易破坏多肽的活性。

另外，制造性地采纳冰醋酸水溶液作为溶媒，也幸免了多肽的损失，提高了溶出度；同时能够除去Ca2+、Mg2+ 等离子，成效优于传统的水提和醇提。

2采纳Sephadex G-50凝胶过滤和高效液相色谱两种层析方式对鹿茸多肽进行分离纯化，既克服了凝胶过滤分离度低的缺点，又弥补了高效液相色谱法处置样品量较小的不足，是一种有效的分离纯化手腕。

3在表皮细胞培育技术中，有几个关键问题：
（1）在接种细胞的进程中，要严格无菌操作，为幸免染菌现象发生，可在培育液中加入少量抗生素。

（2）采纳塑料培育板能提高细胞的贴壁率。

有人指出（6），玻璃培育板接种细胞，仅%贴壁，而有胶原的塑料培育板贴壁率达84%。

（3）胰蛋白酶消化的时刻相当重要，消化时刻太短，表皮与真皮分离不睬想；消化时刻太长，胰酶对细胞有损伤，可阻碍细胞活性。

马圣清等（7）
以为，一样%胰酶，37℃孵箱消化45～60分钟；4℃冰箱消化16～20小时。

本实验采纳%胰酶，37℃水浴中消化30分钟，成效也比较理想。

4 利用细胞培育技术探讨鹿茸多肽的活性，可免用大量整体动物，节省开支，幸免动物种系不同引发的实验结果评判困难，易于在短时间内取得大量细胞，可取得药物与细胞作用的精准浓度；同时，也使实验结果更直观，更靠得住。

但其缺点是，不能代表药物对整个机体的作用。

本次实验因时刻关系，未能做整体药理实验，相信若是采纳离体细胞培育和动物整体实验相结合的方式测定鹿茸多肽活性，结果会更具有说服力。

（附：本文是在长春中医学院新药研究中心刘永强教师的辛勤指导下完成的，同时也取得了该中心王秋玉、朱伟等教师的热情帮忙，在此向他们表示衷心的感激！）
参考文献
1高士贤主编：中国动物药志，吉林科学技术出版社，1996
2江润祥，等。

动物学报，1987；33(4):301
3霍玉书，等。

中药新药与临床药理，1997；8（2）：79
4田恒康，等。

药物分析杂志，1997；17（2）：100
5霍玉书，等。

中药新药与临床药理，1997；8（2）：79
6LiuSc, and serial cultivation of rabbit epithelial Invest Dermatol 1978; 70:288 7马圣清，等。

中华皮肤科杂志，1988；21（3）：131。