系统性红斑狼疮患者程序性死亡因子-1和细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4水平

・临床论著・ 系统性红斑狼疮患者程序性死亡因子-1
和细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4水平
郭飞波韩利蓉
【摘要】 目的分析程序性死亡因子-1（PD-1）和细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）
在系统性红斑狼疮（SLE）患者中的水平。

方法收集2015年6月至2016年3月在我院初诊为SLE
的56例患者作为观察组，根据SLE疾病活动指数（SLEDAI）标准将所有患者分为两组，稳定期组
（28例）和活动期组（28例）。

另选取同期在我院接受体检的28名健康志愿者作为对照组。

采用流
式细胞仪检测空腹静脉血的CD4+ T及CD8+ T淋巴细胞上的PD-1及CTLA-4表达。

结果与对照
组比较，稳定期和活动期SLE的CD4+PD-1+ T淋巴细胞（4.46%±0.95% vs. 2.93%±0.84%，t=6.38，
P＜0.001；5.92%±0.86% vs. 2.93%±0.84%，t=13.16，P＜0.001）和CD8+PD-1+ T淋巴细胞（6.57%±
0.89% vs. 3.31%± 0.84%，t=14.10，P＜0.001；7.37%±0.97% vs. 3.31%±0.84%，t=16.74，P＜0.001）
明显增高；稳定期和活动期SLE的CD4+CTLA-4+ T淋巴细胞（1.03%±0.38% vs. 1.34%±0.47%，
t=2.68，P=0.01；0.73%±0.36% vs. 1.34%±0.47%，t=5.38，P＜0.001）及CD8+CTLA-4+ T淋巴细胞
百分比（0.35%±0.32% vs. 0.69%±0.31%，t=4.04，P＜0.001；0.13%±0.12% vs. 0.69%±0.31%，t=8.91，
P＜0.001）明显降低。

与稳定期SLE比，活动期SLE的CD4+PD-1+ T淋巴细胞（t=6.03，P＜0.001）
及CD8+PD-1+ T淋巴细胞百分比（t=3.22，P=0.003）明显增高，CD4+CTLA-4+ T淋巴细胞（t=3.03，
P=0.01）及CD8+CTLA-4+ T淋巴细胞百分比（t=3.41，P=0.002）明显降低。

CD4+PD-1+的表达与
CD4+CTLA-4+（r=－0.85，P＜0.001）、CD8+PD-1+的表达与CD8+CTLA-4+呈负相关性（r=－0.78，
P＜0.001）。

结论PD-1和CTLA-4参与SLE的发生发展过程，可能通过一定途径抑制PD-1或增
高CTLA-4的表达有望成为SLE的新治疗靶点。

【关键词】 红斑狼疮，系统性；程序性死亡因子-l；细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4
Expression of programmed death-l and T lymphocyte-associated molecule antigen-4 in patients with
systemic lupus erythematosus Guo Feibo, Han Lirong. Department of Clinical Laboratory, Tianmen
First People's Hospital, Hubei Province, Tianmen 431700, China
Corresponding author: Guo Feibo, Email: guofeibo@
【Abstract】 Objective To investigate the programmed death-l (PD-1) and cytotoxic T lymphocyte-
associated molecule antigen-4 (CTLA-4) in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods From
June 2015 to March 2016, 56 case SLE patients were collected, all the patients were divided into active
SLE group (28 cases) and inactive SLE group (28 cases). 28 healthy volunteers were collected as the
control group. CD4+PD-1+ T lymphocyte, CD8+PD-1+ T lymphocyte, CD4+CTLA-4+ T lymphocyte and
CD8+CTLA-4+ T lymphocyte in peripheral blood were detected by flow cytometry and compared within 3
groups. Results Compared with the control group, the CD4+PD-1+ T lymphocyte (4.46%±0.95% vs.
2.93%±0.84%, t=6.38, P<0.001; 5.92%±0.86% vs. 2.93%±0.84%, t=1
3.16, P<0.001) and CD8+PD-1+ T
lymphocyte percentage (6.57%±0.89% vs. 3.31%±0.84%, t=14.10, P<0.001; 7.37%±0.97% vs. 3.31%±0.84%,
t=16.74, P<0.001) had significantly increased and CD4+CTLA-4+ T lymphocyte (1.03%±0.38% vs.
1.34%±0.47%, t=
2.68, P=0.01; 0.73%±0.36% vs. 1.34%±0.47%, t=5.38, P<0.001) and CD8+CTLA-4+ T
lymphocyte percentage (0.35%±0.32% vs. 0.69%±0.31%, t=4.04, P<0.001; 0.13%±0.12% vs. 0.69%±0.31%,
t=8.91, P<0.001) had decreased in 2 SLE groups. Compared with the inactive SLE group, the CD4+PD-1+
DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2016.23.012
作者单位：431700 湖北省天门市第一人民医院检验科
通讯作者：郭飞波，Email: guofeibo@
T lymphocyte (t=6.03, P<0.001) and CD8+PD-1+ T lymphocyte percentage (t=3.22, P=0.003) had significantly increased and CD4+CTLA-4+ T lymphocyte (t=3.03, P=0.01) and CD8+CTLA-4+ T lymphocyte percentage (t=3.41, P=0.002) had decreased in the active SLE group. PD-1 and CTLA-4 were negative connected with each other (r=-0.85, r=-0.78, all P<0.001). Conclusions PD-1 and CTLA-4 play a very important role in the development of SLE. The expression of PD-1 and CTLA-4 might be expected to be a new therapeutic target of SLE through a certain way.
【Key words】 Lupus erythematosus, systemic; Programmed death-l; T lymphocyte-associated molecule antigen-4
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是人类自身免疫性疾病，累及多系统多器官，其发病机制可能与细胞免疫紊乱相关，细胞免疫体系紊乱又以自身反应性T淋巴细胞的活化为典型表现[1-2]。

程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）与负调控分子细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated molecule antigen-4，CTLA-4）均与维持外周T细胞免疫耐受有关[3-4]，其中PD-1与配体PD-L1偶联，导致白细胞介素-2（IL-2）分泌量减少，降低CD4+ T及CD8+ T细胞的克隆能力；CTLA-4一方面与B7分子配体结合，阻止T细胞增殖活化，另一方面促进CD4+ T细胞分泌具有负性调控T细胞免疫反应的转化生长因子β1（TGF-β1）。

因此，本研究拟考察SLE患者PD-1及CTLA-4的变化及与SLE发病的相关性，为SLE提供可能的治疗方法。

资料与方法
一、一般资料
收集2015年6月至2016年3月在天门市第一人民医院初诊为SLE的56例患者作为本研究观察组，根据SLE疾病活动指数（SLEDAI）标准将所有患者分为2组：稳定期SLE组（28例）和活动期SLE组（28例）。

稳定期SLE组中男性10例，女性18例，年龄（38.6±12.5）岁，活动期SLE组中，男性9例，女性19例，年龄（37.9±10.7）岁。

另选取同期在我院接受体检的28名健康志愿者作为对照组，男性10例，女性18例，年龄（37.8±11.8）岁。

3组的性别比和年龄等一般信息具有可比性（P＞0.05）。

排除标准：过敏体质患者；血液系统恶性疾病者；合并有严重的糖尿病、心脑血管疾病和胃肠黏膜相关疾病者；孕期或哺乳期妇女；未签署知情同意书者。

本研究经院内伦理委员会批准。

二、PD-1与CTLA-4检测
所有受试者均于清晨空腹情况下抽取静脉血5 ml，EDTA-K2抗凝，所有样本均加入等容积0.9%氯化钠注射液稀释并混匀。

取6支流式用管，5支为实验管，1支为对照管，5支管分别加入血清样本，各100 μl，5支实验管再分别加入20 μl的anti- CD3-PerCP、anti-CDB-APCCy7、anti-PD-1-FITC、anti- CD4-PECy7及anti-CTLA-4-PE（均购自上海伟寰生物科技有限公司），对照管加同型阴性对照，在避光和室温孵育30 min，加2 ml红细胞裂解液，静置8 min，10 000 r/min（离心半径9.6 cm）离心10 min，除去上清液，加入磷酸缓冲液洗涤，10 000 r/min（离心半径9.6 cm）离心10 min，除上清液，每管再加磷酸缓冲液500 μl重悬细胞。

采用Gallios 流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）进行荧光检测，采用Cell Quest 3.2软件获取并分析细胞，以CD3淋巴细胞群设门，对CD4+ T及CD8+ T淋巴细胞上的PD-1及CTLA-4表达水平进行分析，每个待测样本分析淋巴细胞数5 000个。

三、统计学分析
采用SPSS 19.0统计学软件包进行数据处理分析。

计量资料均以均数±标准差（s
x ）表示，符合正态分布的计量资料组内采用独立样本t检验，相关性分析采用Pearson相关性分析方法。

P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、3组外周血PD-1的表达
与对照组比较，SLE组的CD4+PD-1+ T淋巴细胞及CD8+PD-1+ T淋巴细胞百分比明显增高（P＜0.05），与稳定期SLE比，活动期SLE的CD4+PD-1+T 淋巴细胞及CD8+PD-1+ T淋巴细胞百分比明显增高（P＜0.05）。

见表1，图1。

二、3组外周血CTLA-4的表达
与对照组比较，SLE组的CD4+CTLA-4+ T淋巴细胞及CD8+CTLA-4+ T淋巴细胞百分比明显降低（P＜0.05），与稳定期SLE比，活动期SLE的
表1 3组外周血PD-1+ T细胞的表达（%，s
x±）组别例数 CD4+PD-1+ CD8+PD-1+
对照组 28 2.93±0.84 3.31±0.84 稳定期SLE 28 4.46±0.95a 6.57±0.89a
活动期SLE 28 5.92±0.86ab 7.37±0.97ab
注：与对照组比较，a P＜0.01；与稳定期SLE比较，b P＜0.01
CD4+CTLA-4+ T淋巴细胞及CD8+CTLA-4+ T淋巴
细胞百分比明显降低（P＜0.05）。

见表2，图2。

表2 3组外周血CTLA-4+ T细胞表达水平（%，s
x±）组别例数 CD4+CTLA-4+ CD8+CTLA-4+
对照组 28 1.34±0.47 0.69±0.31 稳定期SLE 28 1.03±0.38a 0.35±0.32a
活动期SLE 28 0.73±0.36ab 0.13±0.12ab
注：与对照组比较，a P＜0.01；与稳定期SLE比较，b P＜0.01
三、3组外周血CD4+ T及CD8+ T细胞上PD-1
和CTLA-4表达的相关性
CD4+PD-1+的表达与CD4+CTLA-4+（r=－0.85，P＜0.001）、CD8+PD-1+的表达与CD8+CTLA-4+（r=
－0.78，P＜0.001）均呈负相关性。

讨 论
SLE属于弥漫性的全身非器官特异性自身免疫
疾病，体内存在明显的免疫改变，临床表现多样，存
在明显的致命性，往往为临床治疗造成极大困难[5]。

流行病学的统计资料显示，近年来SLE的临床发病
率呈现升高趋势，因此如何有效治疗是血液内科亟
须解决的问题。

近些年学者们着手研究SLE发病与
免疫调节功能方面的联系，PD-1与CTLA-4均在T
细胞活化的过程中发挥调控作用，在免疫耐受以及
肿瘤免疫逃逸等均发挥着重要作用，表达异常可导
致免疫耐受遭受破坏。

PD-1是日本科学家于1992年由T细胞杂交瘤
鼠首次分离获得，研究显示PD-1属于CD28超家
族成员，作为免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，广
泛存在于活化的T和B淋巴细胞，PD-L1与PD-L2
是PD-1的两个配体，PD-1与两个配体相互作用表
达出两方面的作用，一方面为正性刺激，即抑制T
细胞抗原受体和CD28诱导的T细胞活化信号，改
变T细胞被激活和分泌细胞因子的阈值，另一方面
为负性刺激，向已激活的T细胞传导抑制信号，负
性调节T细胞激活并维持T细胞免疫耐受。

本研究
结果显示，活动期SLE的CD4+ T及CD8+ T细胞PD-1表达水平高于对照组和稳定期SLE群体，提示PD-1+CD4+ T和PD-1+CD8+ T的百分比越高，病情越活动，PD-1的表达程度与SLE的发病、进展程度关系密切，该结果与文献结果一致[6-8]。

但该结果与PD-1在慢性感染或肿瘤中的功能可能不同，如慢性免疫性血小板减少性紫癜（CITP）治疗前PD-1水平较对照组显著偏低，治疗后明显增高[9]，胃癌患者PD-1+CD4+T细胞水平降低，其分泌γ干扰素（IFN-γ）水平降低，提示慢性感染或肿瘤患者PD-1+CD4+ T和PD-1+CD8+ T细胞可能是衰竭T细胞。

因此，我们推测SLE患者淋巴细胞上PD-1表达增高原因在于PD-L1和（或）PD-L2与PD-1相互作用的正性刺激过强超过了负性抑制作用，致使机体免疫耐受失衡，而对免疫反应的抑制性调控作用难以显现，致使SLE病变。

CTLA-4属于免疫球蛋白超家族分子，1987年由Brunet等[10]在进行小鼠细胞毒性T细胞系cDNA 文库筛选时发现。

目前研究显示CTLA-4表达水平与多种自身免疫疾病有关[11]。

CTLA-4是参与下调T细胞功能的共刺激分子，仅表达在活化的CD4+和CD8+细胞表面。

本研究显示，活动期SLE的CD4+ T及CD8+ T细胞CTLA-4表达水平低于对照组和稳定期SLE群体，提示CTLA-4+CD4+ T和CTLA-4+ CD8+ T的百分比越低，病情越活动越恶化，CTLA-4的表达程度与SLE的发病、进展程度关系密切，该结果与文献一致：活动期SLE患者外周血单个核细胞CTLA-4分子及CTLA-4 mRNA的表达较正常组显著降低。

周树录等[12]认为CTLA-4在T淋巴细胞表达降低与患者T细胞存在CTLA-4分子表达上调缺陷或障碍有关，即SLE患者外周血单个核细胞经伊屋诺霉素刺激后T细胞的CTLA-4分子上调，但与对照组比，其上调幅度明显不足，且CTLA-4分子表达与CTLA-4 mRNA呈现一致表现，而与CTLA-4功能相似的共刺激分子CD28却不存在类似的现象，这种缺陷可使机体对内外刺激的免疫反应过度活化T细胞，引起一系列的细胞免疫与体液免疫反应，致使病理损害，预测这种CTLA-4分子表达上调缺陷或障碍可能存在于基因转录水平。

而且除了SLE，在多种疾病也呈现低表达现象，如在类风湿关节炎中，外周血CD4+CD25+调节性T细胞表面CTLA-4的表达较正常组显著降低[13]，可见淋巴细胞表面的CTLA-4表达降低是多种免疫疾病的共同病理[15-16]。

综上所述，本研究初步证实了负调控分子PD-1
和CTLA-4可能与SLE发病机制具有关联，通过一定途径抑制PD-1或提高CTLA-4表达而抑制T淋巴细胞的过度活化与增殖，维持机体的免疫耐受水平与能力，可能成为SLE治疗的新靶点。

参 考 文 献
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（收稿日期：2016-09-12）
（本文编辑：张志巍）。