中药色谱指纹图谱方法学薄层色谱

S-1 S-2
S-3
S-4
S-5
自左至右：Rbl、Rb2/b3、Rc、Re、NR1、 Rd、Rg1、Rf、F11、F2、Rg2、混合对照品； 西洋参、人参、人参
Rbl Rb2 Rc Re NR-1 Rd Rg1 Rf F11 F2 Rg2 混 西 人参人参 b3、
三七人参(生晒参)
红参
F11 Rf Rg1 Rd Re Rc Rb2 Rbl
6.关于方法学 (1)溶剂系统的优选 文献报道最常用的溶剂系统有：氯仿-甲醇-水(65： 35：10；下层)(S-2)；正丁醇-乙酸乙酯-水(4：l：5； 上层)(S-3)；氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(2：4：2：1； 下层)(S-4)；氯仿-正丁醇-甲醇-水(20：40：15：20； 下层)(S-5)。5种展开溶剂系统比较试验结果：S-1及 展开条件得到的人参皂苷色谱分离度好、斑点容量大 (>18)、斑点相对位置重现性好％) 。
4.展开 于双槽展开箱的一侧加入展开溶剂氯仿-乙酸乙酯甲醇-水(15：40：22：10；8～10℃放置过夜，分取下 层；S-1)20ml(20cm×20cm)或8ml(10cm×10cm)预平衡 15min，放入薄层板展开，常规板展开14cm，高效板展 开7cm；展开温度10～25℃，(Merck预制板25～28℃)； 展开箱内相对湿度控制在42％～45％。
半自动薄层点样器；计算机控制、参数可与薄层 扫描仪共享的全自动薄层点样器；自动展开箱；薄 层色谱成像及图像处理系统。
(2)操作规程的规范化 点样——展开——显色 (3)供试品溶液的预处理
“杂质”——对待测的活性成分或指标成分形 成干扰。不经预处理，很难得到清晰明确的结果。 例
方法：A.加热回流 B.超声提取 C.液液萃取
7. 指 纹 图 谱 分 析
人参
三七
西洋参
生晒人参 西洋参
高丽红参
Rbl
Rb2
Rb3 Rg1
Rc
Ra
微量皂苷14～18号峰
Rf
人参皂苷指纹图谱分区段图 以B区：5—Re、6—未知峰、7—Rd
C区：8、9、10—F11、11—F2、12—Rg2：13—三七皂苷R1
(1)总体分析 西洋参指纹谱较人参简单，主要皂苷斑点很明显，荧光强， 微量皂苷斑点不易察见。人参指纹谱斑点多，微量皂苷易察见， 尤以红参为明显。西洋参皂苷扫描图的各峰的总积分面积高于 人参皂苷各峰的总面积。三七的指纹图谱以Rbl、Re(重叠三七 皂苷R1)、Rgl最突出。 (2)群组分析 薄层色谱扫描图可分辨出18个以上的峰(斑点)，将各个人 参皂苷峰分四个区段。宏观比较，以峰高计，西洋参色谱中A、 B区占优势，D区较难察见；林生参之C区较园种参明显,D区斑 点极弱。人参(生晒参、红参、高丽参)四个区段的峰均可察见， D区峰较西洋参明显，尤以红参明显。吉林生晒人参一般A区>B 区>C区；红参A区>B区<C区，D区的峰比生晒参更明显。
D.固液萃取——样品的提取液通过固相小柱处 理。吸附、键合相分配、正相、反相、离子对、离 子交换原理富集待测组分，去除部分杂质。
如雪莲花, 甲醇提 取液，不经净化处理， 色谱的可见光或荧光图 像与经预处理(Ｃ18小 柱洗脱)的图像比较， 很显然经过预处理将杂 质去除后色谱图像质量 明显提高。
(4)展开溶剂的选择
中药色谱指纹图谱 方法学薄层色谱
2.薄层色谱操作规程
系统适用性试验
检测限 比移值(Rf)
分离度
可选择
可选择
全自动定量点样 自动多次展开
薄 层 指 纹 图 谱 报 告
◆
供试品溶液制备
简
单
手工半定量点样
操
作
玻璃双槽展开箱展开
组
合
显色
拍摄色谱图像照片记录
直观观测(可见光及紫外光)判断样品指纹谱相似度
保持展开溶剂新鲜度
黄连
溶剂系统：苯 -醋酸乙酯-甲 醇-异丙醇-28 ％氨水(6： 3：：：，S1)。
检测：置紫外 光灯(365nm) 下检视
图 黄连的荧光薄层色谱图 1.巴马汀；2.小檗碱；3.表小檗碱； 4.黄连碱；5、6.味连；7、8.雅连；9 、10.云连；11、12.商品黄连；13.药 根碱；14.非洲防己碱
红参A区>B区<C区，D区的峰比生晒参更明显。
温 度——分离度和Rf值 (1)供试液1 样品+甲醇→回流提取→提取液→ 浓缩至近干→水溶解→ 正丁醇萃取→正丁醇液→ 减压蒸干→五氧化二磷真空干燥器中干
燥→ 总皂苷→ 加甲醇溶解，使成每1ml含总皂苷8mg(西洋参、三七为4mg)，作为供试液。 (5)供试品 吉林生晒参、吉林红参、新开河红参、三七、高丽红参、高丽白参、高丽曲参、 西洋参、加拿大西洋参、国产引种西洋参
S1中浓氨液的蒸气相在色谱中起了关键作用： A 仅用S1预平衡15min，氨蒸气量不足，药根碱、非洲防己碱、 巴马汀、小檗碱均不能分开； B 改用浓氨水5ml在一侧槽中预平衡15min后展开，则药根碱+ 非洲防己碱、巴马汀、小檗碱均得到分离； C S1中除去浓氨水，仅用浓氨水预平衡，色谱分离度仍很差； D S1中浓氨水改为水，一侧槽中用浓氨水平衡，分离效果同B。
对照品Байду номын сангаас
西洋参
(2)相对湿度(RH)及温度(AT)对人参皂苷色谱行为 的影响
取硅胶板纵向等距离分隔成5列，点样后在展开箱 内分别以RH32％、42％、47％、58％、65％、72％六 种条件预平衡20min，S-1展开，结果分离度随RH降低 而提高，RH32％时最佳。
RH 32％ 42％
47％ 58％
调整蒸气浓度 固液萃取——样品的提取液通过固相小柱处理。
氨及其去氧胆酸分开；
改善色谱质量
微观分析，西洋参色谱均呈一高(2-Rbl)一低(4-Rc)的二重峰，B区<A区，一高(5-Re)一低(7-Rd)的二重峰(林生参)或三重峰(5、6、7) ；
展开温度10～25℃，(Merck预制板25～28℃)；
黄连碱
表小檗碱 小檗碱 巴马汀
大 黄 游离蒽醌薄层色谱分析, 展开剂为石油醚(30～
60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)，用新鲜开瓶的甲酸乙酯时，5 种游离蒽醌分离度很好。若用反复多次开瓶使用的甲酸乙酯时， 由于甲酸乙酯吸收了空气中水分而或多或少分解而导致色谱的 分离度大大降低。 或配好的展开剂 反复多次使用， 各溶剂比例改变， 色谱重现性差。
18℃
27℃
(3)显色及扫描方式的选择 文献多用30％～5O％硫酸喷雾显色，经改进为5％～ 10％硫酸乙醇液喷雾或浸渍后，立即加热显色，以免斑 点在原位扩散。Merck预制板用浸渍法显色。 扫描方式由通常用的可见光扫描改为荧光扫描，灵 敏度提高9倍以上。Rbl，Re，Rgl的最低检出量为～。
A—荧光扫描 B—可见光扫描
1.芦荟大黄素 2. 大黄酸 3.大黄素 4.大黄素甲醚 5. 大黄酚
(6)环境因素的影响
相对湿度——分离度 （牛胆汁：RH<30％,牛磺、甘
经比较5～10℃分层。 经比较5～10℃分层。
氨及其去氧胆酸分开；RH>72％，四种分不
相对湿度——分离度 （牛胆汁：RH<30％,牛磺、甘
开） Rbl Rb2 Rc Re NR-1 Rd Rg1 Rf F11 F2 Rg2 混 西 人参人参
B区均为二重峰(5-Re 、7-Rd),无6号峰；
展开前蒸气预平衡 置五氧化二磷真空干燥器放置过夜，展开前置薄层板于Vario-KS槽中于相对湿度42％～48％条件下预平衡15min。
人参指纹谱斑点多，微量皂苷易察见，尤以红参为明显。
(1)器材的规范化
(2)薄层板 自制硅胶板；
C区特点是有8-Rgl、10-F11 、11-F2，无9-Rf 、12-Rg2；
（4)试药 氯仿(精制、重蒸)、乙酸乙酯、正丁醇、 甲醇(分析纯)。
(5)供试品 吉林生晒参、吉林红参、新开河红参、 三七、高丽红参、高丽白参、高丽曲参、 西洋参、加 拿大西洋参、国产引种西洋参。
2.样品预处理 (1)供试液1 样品+甲醇→回流提取→提取液→ 浓 缩至近干→水溶解→ 正丁醇萃取→正丁醇液→ 减压蒸 干→五氧化二磷真空干燥器中干燥→ 总皂苷→ 加甲醇 溶解，使成每1ml含总皂苷8mg(西洋参、三七为4mg)，作 为供试液。
。
展固开液前 萃蒸取气—预—平样衡品三的提七取液药通过固材相小中柱处的理。三七皂苷R１与人参皂苷Re只有在低温
(<10℃)才能分开。 人参皂苷指纹图谱分区段图
置五氧化二磷真空干燥器放置过夜，展开前置薄层板于Vario-KS槽中于相对湿度42％～48％条件下预平衡15min。
(1)总体分析
林生参之C区较园种参明显,D区斑点极弱。
展开剂———薄层色谱的关键
展开剂优化———依靠经验
鉴别判断信息多
展开剂要求———分离度高，斑点多。
展开剂最优化模式难以计算：
（1）样品中多类别成分共存，优化模式难以外延。
（2）溶剂蒸气在展开中起着举足轻重作用，但又 难以获得可测量的参数
(5)溶剂蒸气对色谱行为的影响
薄层色谱——“开放”环境下展开，展开剂蒸气 也参与展开全过程。
(2)供试液2 甲醇回流液→适当浓缩→碱性氧化铝 小柱→50％甲醇洗脱→洗脱液→减压蒸干→残渣→加水 溶解→水溶液→ Sep-Pak C18小柱→甲醇洗脱→甲醇液→ 蒸干→ 残渣→甲醇溶解，使每1ml含8mg(人参总皂苷)或 4mg(西洋参或三七总皂苷)，作为供试液。（除去人参皂 苷Ro，特别因用预制板时，人参皂苷Ro与人参皂苷Rbl或 Rb2重叠。）
3.点样 用微升毛细管分别吸取人参皂苷混合对照品甲醇液 (4mg／ml)，人参、西洋参、三七供试液各1μl，点样于 硅胶板上，原点直径<2mm或各吸取点样于高效板上，
原点直径<1mm。或Linomat点样设备或全自动点样器 (ATS3)条带状喷雾点样于预制板上或高效板上。置五氧 化二磷真空干燥器放置过夜，展开前置薄层板于VarioKS槽中于相对湿度42％～48％条件下预平衡15min。
C区有8-Rgl、9-Rf、12-Rg2，无10-F11、11-F2；
R + R (1)总体分析
展开剂最优化模式难１以计算： e
吸附、键合相分配、正相、反相、离子对、离子交换原理富集待测组分，去除部分杂质。
人参皂苷指纹图谱分区段图
展开温度10～25℃，(Merck预制板25～28℃)；
C区：8、9、10—F11、11—F2、12—Rg2：13—三七皂苷R1
5.显色及扫描 用5 ％ 硫酸 乙醇 液 喷 雾或 浸渍 ( 预 制板 ) ， 100 ～ 105℃加热至斑点显色清晰为度。于可见光下观察红色 至红紫色斑点(或条带)；紫外光灯(366nm)下观察紫红 色荧光(人参二醇型皂苷)或橙色荧光(人参三醇型及奥 可梯隆型皂苷)斑点(或条带)。为了加强荧光强度，可 于显色后，再喷雾或浸渍液体石蜡-己烷(1：1)混合溶 剂。 扫描：荧光方式，λex366nm，滤光片K400。
65％ 72％
展开时温度，用S-1于10℃及28℃分别展开，温度高， 斑点位置抬高，斑点扩散。溶剂系统配制时放置分层的 温度也很重要，25℃以上放置混合溶剂不分层，展开效 果很差。如在低于分层温度下展开，则溶剂系统脱混， 色谱扭曲变形。经比较5～10℃分层。10～25℃展开为宜。
10℃ 28℃
10℃以下 28℃不分层 10℃
R１
Re
Re
R１
实例——人参类药材薄层色谱指纹图谱
1.试验材料及仪器 (1) 对照品 人参皂苷Ro、Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、 Re、Rf、Rgl、Rg2、F2、伪人参皂苷F11、三七皂苷-Rl。 (2)薄层板 自制硅胶板；预制硅胶60F254板 (20cm×20cm)；高效板10cm×10cm(Merck)。 (3)仪器 Nanomat-Ⅲ、-Ⅱ点样器及全自动点样器、 双槽展开缸、VARIO-KS展开槽、HPTIC VARIO展开槽、薄 层色谱条件控制槽、薄层扫描仪(均为瑞士CAMAG产品)、 HP9482薄层色谱扫描软件、CATS薄层色谱扫描及评价软 件(CAMAG)、薄层色谱摄像仪(Reprostar，CAMAG)。
◆
供试品溶液制备
复
计算机控制半自动或全自动定量点样
杂
操
玻璃双槽展开箱展开或自动展开箱展开
作
组
显色
合
拍摄色谱图像照片记录
直观观测(可见光及紫外光)
数码成像及 数据处理
计算机相 似度评价
薄层扫描积分数据
3.薄层色谱的规范化
(1)器材的规范化
固液萃取小柱；定量微升毛细管；标准展开箱或 双槽展开箱；预制薄层板；展开条件控制槽；紫外 光灯；显色喷雾器或浸渍显色用玻璃缸；薄层色谱 扫描仪。