水蛭素对特发性肺间质纤维化大鼠肺组织中纤溶酶原抑制剂1(PAI1)mRNA及蛋白表达的干预研究

水蛭素对特发性肺间质纤维化大鼠肺组织中纤溶酶原
抑制剂-1(PAI-1) mRNA及蛋白表达的干预研究Intervention study of hirudin on the expression of plasminogen inhibitor-1 (PAI-1) m RNA and protein in lung tissue of rats with
idiopathic pulmonary fibrosis
李红1谢海彬2*刘敏2沈明霞2王海霞3马玉坤3
（1.深圳市罗湖区中医院，广东深圳，518001；2. 甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州，730000；
3.甘肃中医药大学，甘肃兰州，730000）
中图分类号：R-33文献标识码：A文章编号：1674-（2019）05-0001-06
【摘要】目的：本研究选用天然水蛭素作为研究药物，采用RT-qPCR 、Western blot方法检测IPF大鼠肺组织中PAI-1 mRNA及蛋白表达，观察水蛭素干预大鼠IPF的作用，探讨其可能的作用机制，为临床运用水蛭治疗IPF提供理论依据，从而拓宽IPF的治疗途径。

方法：选取180只SPF级同月龄健康的Wistar大鼠，随机数字表法抽取18只大鼠作为空白（K）组，剩余162只大鼠气管内注射博莱霉素统一造模，造模成功后随机选取108只分为模型（M）组、激素（J）组、水蛭素高剂量（G）组、水蛭素中剂量（Z）组、水蛭素低剂量（D）组、水蛭素中剂量联合激素（ZJ）组，每组18只，造模成功后第2天开始给药，分别在造模后7 d、14 d、28 d处死大鼠并收集标本，采用Western blot法检测大鼠肺组织中PAI-1的蛋白表达，RT-qPCR法检测PAI-1的基因表达。

结果：不同时间点，M组大鼠肺组织PAI-1基因和蛋白表达均最强（P＜0.01），而且随着时间的推移,表达强度逐渐增强，说明肺纤维化处于发展趋势，28天大鼠肺间质纤维化程度最重。

各用药组进行比较发现：在7 d、14 d、28 d，ZJ 组大鼠肺组织PAI-1基因和蛋白表达均最弱（P＜0.01），G组次之（P＜0.01），J组表达仅次于G组（P＜0.01），J组表达显著低于Z组和D组（P＜0.01），而Z组和D组相当（P＞0.05）。

结论：本实验证明，水蛭素具有治疗大鼠肺间质纤维化的作用，通过降低PAI-1基因和蛋白表达水平从而起到治疗大鼠肺间质纤维化是其作用机理之一。

同样发现，水蛭素的治疗作用有明显的剂量依赖性，而水蛭素联合激素治疗大鼠肺间质纤维化的疗效更佳。

【关键词】特发性肺纤维化；水蛭素；纤溶酶原抑制剂-1
【Abstract】Objective: To study the expression of PAI-1 mRNA and protein in lung tissue of rats with IPF by RT-qPCR and Western blot, and observe the effect of hirudin on IPF in rats. The mechanism of action provides a theoretical basis for the clinical application of leech treatment of IPF, thereby broadening the treatment of IPF. Methods: 180 healthy Wistar rats of SPF class were selected.
18 rats were randomly selected as blank (K) group. The remaining 162 rats were intratracheally injected with bleomycin to form a model. 108 rats were randomly divided into model (M) group, hormone (J) group, hirudin high dose (G) group, medium dose (Z) group, low dose (D) group, hirudin medium dose combined hormone (ZJ) groups, 18 rats in each group, were administered on the second day after successful modeling. The rats were sacrificed at 7 days, 14 days, and 28 days after model establishment, and the samples were collected. The protein of PAI-1 in rat lung tissue was detected by Western blot. Expression, gene expression of PAI-1 was detected by RT-qPCR. Results: At different time points, the expression of PAI-1 gene and protein in lung tissue of M group was the strongest (P<0.01), and the expression intensity increased gradually with time, indicating that pulmonary fibrosis is in the development trend; The degree of pulmonary interstitial fibrosis of 28-day rats is the heaviest. Comparing with the drug groups, the expression of PAI-1 gene and protein in the lung tissue of ZJ group was the weakest at 7 days, 14 days and 28 days (P<0.01), followed by G group (P<0.01). The expression of J group was second only to G group (P<0.01), and the expression of J group was significantly lower than that in the Z group and the D group (P<0.01), while Z group and D group were equivalent (P>0.05). Conclusion: hirudin has the effect of treating pulmonary interstitial fibrosis in rats. It is one of the mechanisms of action to treat pulmonary interstitial fibrosis in rats by reducing the expression level of PAI-1 gene and protein. It was also found that the therapeutic effect of hirudin was significantly dose-dependent, and that hirudin combined with hormones was more effective in treating pulmonary interstitial fibrosis in rats.
【Keywords】Idiopathic pulmonary fibrosis; Hirudin; Plasminogen inhibitor-1
doi:10.3969/j.issn.1674-7860.2019.05.001
特发性肺间质纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是一种在影像学和（或）组织学类型符合寻常型间质性肺炎（Usual Interstitial Pneumonia，UIP），原因不明，发生于成人的、慢性的、进行性、纤维化性间质性肺炎[1]。

其发病机制复杂，最新研究表明[1]，IPF的发生发展过程中凝血系统的异常也发挥着重要作用。

纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plas minogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）是纤溶系统的重要组成成分，是纤溶酶原活化系统（PAs）的调节物。

肺组织纤维化过程中，PAI-1与尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）在ECM 降解过程扮演重要角色，PAI-1作为uPA快速、专一、有效的抑制因子，当PAI-1升高时，就会抵消uPA升高所产生的基质降解，使得ECM增多、沉积，从而促进肺纤维化的发生、发展[2]。

而中医活血化瘀疗理论在中医药治疗IPF的研究中运用广泛[3,4]，其中水蛭的运用尤为普遍。

本人在临床工作中发现，水蛭的应用能够改善IPF患者低氧血症，相关的临床研究同样表明[5-8]，以水蛭为主药的中药复方联合运用对IPF患者的肺功能、动脉氧分压、影像学变化及临床症状均有明显改善作用，并能改善IPF患者的生存质量，取得了较好的临床疗效。

水蛭素作为水蛭的主要活性成分，是凝血酶的特异性抑制剂，于是我们推测水蛭素具有干预IPF的作用，其作用途径可能是通过干预PAI-1的表达减少肺间质内ECM沉积并促进其降解，从而改善IPF的病情。

1材料与方法
1.1 实验动物
甘肃中医药大学动物实验中心购买的SPF级同月龄Wistar大鼠180只，雌雄各半，动物合格证号：2015-005-62001000000305。

甘肃中医药大学SPF级实验动物中心饲养大鼠。

室温：25℃左右，湿度20%～30%，灯光适合。

动物实验设施使用证编号：SYXK（甘）2015-0005-00000340。

1.2 药物及试剂
水蛭素100 A T-U/mL，批号：740422，购于南宁市金海科康生物医药科技有限公司；醋酸泼尼松片2.5 mg/片，批准文号：H32021728，江苏鹏鹞制药股份有限公司提供，购于甘肃中医药大学附属医院西药房；注射用盐酸博莱霉素15 mg/支，批号：国药准字H20110986，日本化药株式会社；4%多聚甲醛溶液100 mL/500 mL、高效RIPA组织/细胞裂解液20 mL/100 mL、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、4×蛋白上样缓冲液、ECL曝光试剂盒，均购于北京索莱宝科技有限公司；Anti-PAI1抗体1 mL，批号：ab66705，艾博抗（上海）贸易有限公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）2.0 mL，批号：ZB-2305，北京中杉金桥公司；内参GAPDH（FL-335），批号：ZS-25778，北京中杉金桥公司；RNA提取试剂 TRIzol Reagent 200 mL，批号：15596-018，购于Ambion公司；实时荧光定量PCR引物（PAI-1），批号：TH10034，购于宝生物工程（大连）有限公司；β-actin，批号：HE3009，购于宝生物工程有限公司。

1.3 实验器材
美国Media Cybemetics公司Image-Pro Plus专业图像分析软件、日本OLYMPUSCX21型生物显微镜、德国RM2135石
蜡切片机、日本TEC-VEM-J2石蜡包埋机、日本VIP-5JR-J2石蜡脱水机、Benchmark Plus酶标仪BIO-RAD、Amershan Biosciences MINIVE COMPLETE垂直蛋白电泳槽、MIGHTY SMALL TRANSPHOR转膜仪Amershan Biosciences、C300全自动生物分析成像系统Azure Biosystems、上海力申科学仪器有限公司生物安全柜HFsafe-1200TE、基因有限公司ND2000c 分光光度计、美国Bio-rad CFX96荧光定量PCR仪、美国Bio-rad S1000 PCR仪。

1.4 研究方法
1.4.1 实验动物与分组
随机数字表法从180只大鼠随机抽取18只大鼠作为K组，余162只大鼠统一气管内推注博莱霉素（剂量2 mg/kg）造模，造模分两组同时进行，从造模成功的大鼠中随机选取108只按随机（余数法）分为M组、J组、G组、Z组、D组、ZJ组，每组18只，按雌雄分笼饲养。

每组大鼠均用苦味酸在大鼠的头部、背部、四肢及尾部等部位进行编号，做好登记。

1.4.2 模型制作
将大鼠固定架置于操作台上。

用10%水合氯醛（按1 mL/100 g的剂量）麻醉大鼠，麻醉后将大鼠固定于固定架上，充分暴露颈部。

备皮后用碘伏消毒局部皮肤，沿大鼠颈部正中线行约1.5 cm的切口。

用镊子钝性分离肌肉，用眼睑拉钩固定两侧肌肉，使气管完整的暴露在术野中。

暴露气管后，一手持一次性注射器，选靠近肺部的部位进针（进针角度与气管约15°，避免穿透气管后壁），有落空感后，注射器微微上翘使针头平行进入，待针头完全进入后缓慢匀速的推注博来霉素溶液（规格：15 mg/支，以生理盐水配制2 mg·mL-1溶液，按2 mg·kg-1体重给药），注射完毕后，立即将大鼠置头高脚低竖直位轻轻左右旋转摇晃约1 min，保证药液完全、充分、均匀的分布于肺组织中。

缝合颈部肌肉和皮肤并消毒。

1.4.3 造模成功后给药
造模后第2日开始给药，每日1次。

①K组和M组：按1 mL/100 g体重给予0.9% NaCl注射液皮下注射，同时予以0.5%羧甲基纤维素钠溶液1 mL/100 g体重灌胃；②J组：按3 mg/（kg·d）给予浓度为0.3 mg/mL醋酸泼尼松溶液（0.5%羧甲基纤维素钠助溶）灌胃；③水蛭素组：使用0.9% NaCl注射液将水蛭素冻干粉配制成25、50、100 A T-U/mL的溶液，供G组、Z组、D组动物皮下注射使用，给药剂量为1 mL/（kg·d）；④ZJ组：按3 mg/（kg·d）给予浓度为0.3 mg/mL醋酸泼尼松溶液灌胃并按1 mL/（kg·d）给予中等浓度水蛭素溶液皮下注射。

1.4.4 标本采集与指标检测
造模后第7 d、14 d、28 d各组随机抽取6只大鼠，脱颈处死，充分暴露心肺，完整分离肺组织，高纯水冲洗，取右肺固定后供HE、Masson染色等病理学检测，左肺组织储存于-80℃冰箱中，用于Western blot及RT-qPCR检测。

1.4.5 肺组织病理损伤、肺纤维化判断
染色后，高倍显微镜下观察肺组织炎症病变及纤维化病变的情况。

根据Szapiel标准评分方法[9]进行肺组织病理损伤评分：无肺泡炎，0分；轻微的炎性细胞聚集，无明显病理形态学改变，1分；肺泡间隔因细胞浸润增宽，病变范围局限在
全肺的20%以下，2分；病变范围占全肺的20%～50%，3分；呈弥漫性分布，病变范围＞50%，4分。

Masson染色后进行纤维化程度评分：无纤维化（－），0分；轻度肺纤维化（＋），受累范围＜20%，1分；中度肺纤维化（＋＋），受累范围占全肺的20%～50%，肺泡结构紊乱，2分；重度肺纤维化（＋＋＋），受累范围＞50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱，3分。

1.5 统计学方法
采用SPSS 16.0软件进行统计分析，服从正态分布用参
ANOV A进行总体比较，有差异进行LSD两两比较，不服从正态分布用秩和检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果
2.1 HE染色结果
K组各时间点大鼠肺组织结构完整，均无明显病理改变。

M组：7 d时，大量炎症细胞充斥于肺泡间隙和血管壁中，肺泡壁增厚，间隔水肿，伴大量炎症细胞浸润，可见泡沫样细胞形成，部分成纤维细胞聚集，透明膜形成；14 d时，肺泡炎性细胞较前减少，肺泡壁明显增厚，间隔增宽，可见大量成纤维细胞及细胞外基质，病灶内可见少量纤维组织增生；28 d 时，炎症逐渐减轻，正常的肺泡结构破坏，肺泡间隔断裂，伴大量成纤维细胞及胶原沉积，肺纤维化瘢痕形成。

（不同组别不同时间点HE染色图片如图1）。

2.2 Masson染色结果
K组大鼠肺泡区可见少量浅蓝色胶原纤维，支气管壁胶原层较薄。

M组：7 d时，在支气管壁、血管壁及肺泡间隔均可见蓝色胶原纤维；14 d时，细胞外基质明显增多，大量纤维增生出现，各级支气管、血管外壁及肺泡隔内均可见蓝色胶原纤维；28 d时，各区域均可见大量蓝色胶原纤维增生，弥漫性肺纤维化形成。

（不同组别不同时间点Masson染色图片如图2
）
空白组7 d 空白组14 d 空白组
28 d
模型组7 d 模型组14 d 模型组28 d
图1 大鼠肺组织HE染色（×200
）
空白组7 d 空白组14 d 空白组
28 d
模型组7 d 模型组14 d 模型组28 d
图2 大鼠肺组织Masson染色（×200）
2.3 大鼠肺组织病理损伤及纤维化情况
不同时间点，各处理组大鼠与K组相比，M组肺组织损伤及纤维化评分均显著增高（P＜0.01），详见表1。

表1各组大鼠不同时间点肺组织病理学评分（
组别
肺组织病理损伤肺纤维化程度
造模后7天造模后14天造模后28天造模后7天造模后14天造模后28天
K组0.44±0.510.50±0.510.56±0.510.29±0.460.23±0.430.25±0.44
M组 3.44±0.70▲ 3.22±0.73▲ 2.28±0.75▲ 1.86±0.59▲ 2.27±0.60▲ 2.66±0.55▲注：肺组织病理损伤及肺纤维化：与K组比较，各组▲P＜0.01。

2.4 PAI-1蛋白的表达各组IPF大鼠肺组织PAI-1蛋白的表达比较，见表2。

表2IPF大鼠肺组织PAI-1蛋白的表达（
组别鼠数7 d14 d28 d
K组180.06±0.070.39±0.040.22±0.02
M组180.59±0.060.88±0.060.93±0.10
J组18 0.36±0.04▲ 0.72±0.08▲0.75±0.09▲
G组18 0.29±0.03▲△ 0.72±0.06▲0.61±0.09▲△
Z组18 0.45±0.03▲△★ 0.85±0.09△★0.66±0.11▲△
D组18 0.52±0.05▲△★☆ 0.84±0.08△★0.73±0.08▲★☆
ZJ组18 0.26±0.06▲△☆ 0.60±0.06▲△★☆0.41±0.03▲△★☆
注：与K组比较，各组P＜0.01；与M组比较，▲P＜0.01；与J组比较，△P＜0.01；与G组比较，★P＜0.01；与Z组比较，☆P＜0.01；ZJ组与D剂量组比较，P＜0.01。

图3 不同组别7天大鼠肺组织PAI-1
蛋白表达比较
图4 不同组别7天大鼠肺组织PAI-1蛋白WB 图谱
造模后第7天，各处理组与K 组比较，大鼠肺组织PAI-1蛋白的表达显著增强（P ＜0.01）。

各用药组与M 组比较，大鼠肺组织PAI-1蛋白含量显著降低（P ＜0.01）。

各用药组PAI-1蛋白表达情况不一，其中ZJ 组表达强度较其他各用药组低（P ＜0.01），而D 组蛋白含量最大（P ＜0.01），与G 组比较，J 组与Z 组大鼠肺组织PAI-1蛋白表达显著增强 （P ＜0.01），而Z 组蛋白表达明显高于J 组（P ＜0.01），见图3、4。

图5 不同组别14天大鼠肺组织PAI-1
蛋白表达比较
图6 不同组别14天大鼠肺组织PAI-1蛋白WB 图谱
造模后第14天，各处理组与K 组比较，大鼠肺组织PAI-1蛋白的表达显著增强（P ＜0.01）。

各用药组与M 组比较，Z 组与D 组肺组织PAI-1蛋白的表达与其相当（P ＞0.05），J 组、G 组和ZJ 组蛋白表达显著降低（P ＜0.01），其中ZJ 组蛋白含量最低（P ＜0.01），J 组与G 组相当（P ＞0.05），且J 组、G 组蛋白含量明显低于Z 组和D 组（P ＜0.01），Z 组与D 组相当（P ＞0.05），见图5、6。

图7 不同组别28天大鼠肺组织PAI-1
蛋白表达比较
图8 不同组别28天大鼠肺组织PAI-1蛋白WB 图谱
造模后第28天，各处理组与K 组比较，大鼠肺组织PAI-1 蛋白的表达均显著增强（P ＜0.01）。

各用药组与M 组比较，PAI-1蛋白的表达均显著增强（P ＜0.01）。

与J 组比较，D 组与其相当（P ＞0.05），余各用药组大鼠肺组织PAI-1蛋白的表达均有显著差异（P ＜0.01）。

水蛭素干预组中，ZJ 组蛋白表达最低（P ＜0.01），D 剂量组蛋白表达最高（P ＜ 0.01），而G 组与Z 组相当（P ＞0.05），见图7、8。

2.5 PAI-1mRNA 的表达
各组IPF 大鼠肺组织PAI-1mRNA 表达比较，见表3。

表3 IPF 大鼠肺组织PAI -1m RNA 的表达（
组别鼠数7 d 14 d 28 d K 组18 0.96±0.30 0.77±0.29 1.16±0.21M 组1811.78±2.19 20.82±7.0924.98±4.44J 组18 6.85±1.45▲ 11.44±4.19▲ 18.38±2.74▲G 组18 4.18±0.94▲△ 8.56±2.87▲ 17.77±5.26▲Z 组18 7.03±1.81▲★ 13.33±3.17▲★ 19.78±4.54▲D 组18 8.14±1.29▲★ 18.24±5.78△★☆ 22.31±4.37△★ZJ 组
18
3.51±0.58▲△☆
7.83±2.32▲☆
14.49±3.71▲△☆
注：与K 组比较，各组P ＜0.01；与M 组比较，▲P ＜0.01；与J 组比较，△P ＜0.01；与G 组比较，★P ＜0.01；与Z 组比较，☆P ＜0.01；ZJ 组
与D 组比较，P ＜0.01。

图9 7天大鼠肺组织PAI-1mRNA 表达比较
造模后第7天，各处理组与K 组比较，大鼠肺组织PAI-1 mRNA 的表达均显著增强（P ＜0.01）。

各用药组与M 组比较，PAI-1 mRNA 的表达均显著增强（P ＜0.01）。

与J 组比较，Z 组和D 组与其相当（P ＞0.05），余各用药组大鼠肺组织PAI-1 mRNA 的表达均有显著差异（P ＜0.01）。

水蛭素干预组中，ZJ 组与G 组相当（P ＞0.05），且均处于低表达水平 （P ＜0.01），而Z 组与D 组相当（P ＞0.05），见图9。

图10 14天大鼠肺组织PAI-1mRNA 表达比较
造模后第14天，各处理组与K 组比较，大鼠肺组织PAI-1 mRNA 的表达均显著增强（P ＜0.01）。

各用药组与M 组比较，D 组与其相当（P ＞0.05），余各干预组PAI-1 mRNA 的表达均显著降低（P ＜0.01）。

与J 组比较，G 组、Z 组和ZJ 组均与其相当（P ＞0.05），D 组大鼠肺组织PAI-1 mRNA 的表达显著增强（P ＜0.01）。

水蛭素干预组中，ZJ 组与G 组相当（P ＞0.05），且均处于低表达水平（P ＜0.01），而Z 组表达较D 组低（P ＜0.01），见图10。

图11 28天大鼠肺组织PAI-1mRNA 表达比较
造模后第28天，各处理组与K 组比较，大鼠肺组织PAI-1 mRNA 的表达均显著增强（P ＜0.01）。

各用药组与M 组比较，D 组与其相当（P ＞0.05），余各干预组PAI-1 mRNA 的
表达均显著降低（P ＜0.01）。

与J 组比较，G 组、Z 组均与其相当（P ＞0.05），D 组大鼠肺组织PAI-1 mRNA 的表达显著增强（P ＜0.01），而ZJ 组表达降低（P ＜0.01）。

水蛭素干预组中，ZJ 组、G 组和Z 组三者之间表达相当（P ＞ 0.05），且明显低于D 组（P ＜0.01），见图11。

3 讨 论
IPF 的主要病理表现为出现成纤维细胞灶，大量细胞外基
质（Extra Cellular Matrix ，ECM ）沉积，使胶原积聚，肺泡结构被破坏，最终正常肺组织结构被破坏出现纤维化[10]。

本实验中HE 及Masson 染色镜下观察大鼠肺组织K 组结构正常，未见明显病变，而M 组大鼠造模初期，有明显的炎症反应，主要表现为中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的浸润，组织充血肿胀，肺间质略有增厚；中期炎症不明显，开始出现细胞外基质、胶原纤维、成纤维细胞的聚集和沉积，肺泡壁增厚；晚期明显的肺泡结构硬化破坏，形成蜂窝囊，丧失肺泡功能。

说明该实验模型造模成功。

IPF 发病机制复杂，随着研究的深入，出现了一些假说，如慢性炎症假说，肺泡上皮细胞异常损伤与修复假说等。

最新研究表明[1]，IPF 的发生发展过程中凝血系统的异常也发挥着作用，IPF 患者的凝血活性升高，同时其抗凝及纤溶活性也会相应减低，使肺内的炎症反应受到影响，导致纤维蛋白沉积、成纤维细胞附着、肺组织重塑，最终造成纤维化的出现，而纤溶酶原激活物抑制剂-1在这个产生肺部炎症及纤维化的过程中扮演着重要角色。

PAI-1是纤溶系统的重要组成成分，是纤溶酶原活化系统的调节物。

肺组织纤维化过程中，PAI-1与尿激酶型纤溶酶原激活物在ECM 降解过程扮演重要角色，PAI-1作为uPA 快速、专一、有效的抑制因子，当PAI-1升高时，就会抵消uPA 升高所产生的基质降解，使得ECM 增多、沉积，从而促进肺纤维化的发生、发展[2]。

由此可见PAI-1在肺纤维化发生和发展中发挥着重要作用。

近年来，中医药在防治IPF 的临床和实验研究方面取得了很多成果，回顾相关文献，结合现代研究结果，目前中医学界普遍认为在IPF 发生发展过程中，肺脾肾亏虚作为内在因素是主要原因。

疾病发展过程中肺脾肾三脏相互影响，随着病情的迁延不愈，由肺及脾及肾，终致三脏出现一派虚象，使其功能失调，而肺脾肾均与痰相关，久病又可生瘀，痰瘀互结，进一步损伤正气，使得机体正气俞虚，病情加重[10]。

由此可见，痰瘀即是病理产物，同时又是使其加重的重要因素。

气虚无力行血使得肺络受阻，阻滞不通则为血瘀，血瘀又可导致气机不畅，出现各种痰瘀阻滞，气滞血瘀的征象。

痰和瘀二者又可相互化生，可因痰致瘀，或因瘀致痰，最终出现痰瘀互结之征象[11]。

由此可见，对于IPF 的治疗，化痰同时更要注重活血化瘀。

而在中医药治疗IPF 的研究中[12-14]，无论分期辨证治疗、中药复方治疗还是单味药治疗都可见到对中医活
血化瘀疗理论的运用，其中对于中药活血化瘀药水蛭的运用尤为普遍。

水蛭，咸、苦，平。

归肝经。

咸苦入血，破血逐瘀力强。

《本草汇言》中记载：水蛭为“逐恶血、瘀血之要药也”。

现代
药理研究表明[15]，水蛭含有水蛭素、肝素和抗血栓素，它能够延缓机体内外血液凝结的速度，使血液粘稠度下降，因此就具有中医所说的活血的作用。

水蛭素作为水蛭的主要活性成分，是凝血酶的特异性抑制剂，水蛭素通过减少凝血酶在肺内的表达，通过降低PAI-1含量及活性，从而减少纤维蛋白沉积和加速胶原降解[16]。

水蛭素能显著下调肾小球系膜细胞 PAI-1 mRNA的表达，拮抗ECM合成与降解的失衡[17]，下调结缔组织生长因子（CTGF）mRNA的表达，抑制肝脏细胞外基质异常增生[18]。

可调节碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子（TGF-β1）分泌，抑制成纤维细胞的生长、增殖并进一步抑制瘢痕形成，抑制 P AI-1生成及活性，减少纤维蛋白沉积[19]。

以水蛭为君药的芪蛭皱肺颗粒可显著提高大鼠肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）表达，改善肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构[20]，并能降低层粘蛋白（LN）、透明质酸（HA）在血清中的含量及肺组织中的沉积，影响肺纤维化进程[21]。

本实验从基因和蛋白两个层面来观察PAI-1的表达情况，从而来评估大鼠肺间质纤维化的程度。

实验发现：不同时间点，M组大鼠肺组织PAI-1基因和蛋白表达均最强（P＜0.01），而且随着时间的推移表达强度逐渐增强，说明肺纤维化处于发展趋势，28 d大鼠肺间质纤维化程度最重。

各用药组进行比较发现：在7 d、14 d、28 d，ZJ组大鼠肺组织PAI-1基因和蛋白表达均最弱（P＜0.01），G组次之（P＜0.01），J组表达介于其间（P＜0.01），J组表达显著低于Z组和D组（P＜0.01），而Z组和D组相当（P＞0.05）。

说明高剂量水蛭素治疗效果优于激素，而且水蛭素与激素联合用药具有疗效协同作用。

本实验证明，水蛭素具有治疗大鼠肺间质纤维化的作用，通过降低PAI-1基因和蛋白表达水平从而起到治疗大鼠肺间质纤维化是其作用机理之一。

同样发现，水蛭素的治疗作用有明显的剂量依赖性，而水蛭素联合激素治疗大鼠肺间质纤维化的疗效更佳。

为临床运用水蛭治疗IPF提供理论依据，从而拓宽IPF的治疗途径。

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基金项目：
甘肃省科技厅自然基金（1308RJZA197）。

作者简介：
李红(1968－)，女，医学硕士，教授，硕士生导师，主任医师，主要从事中西医结合防治肺系疾病的研究。

谢海彬（1987－），通讯作者，住院医师，主要从事中西医结合防治肺系疾病的研究。

编辑：田杏茹编号：EA-3180917153（修回：2019-02-12）。