维生素D测定方法

维生素D测定方法
维生素D的测定方法，目前只有“婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法”介绍的GB/T 5413.9-1997所列的先正相收集，后反相分离的HPLC测定方法。

该法可同时测定A.D.E，但操作比较烦琐，对于维生素的营养素补充剂，样品中杂质干扰小，在测定A.E的同时可控制采样量和色谱的分离条件，并参照GB/T 5413.9-1997与GB/T 5009.82-2003（食品中维生素A和维生素E的测定）的方法检测营养补充剂维生素D也可同时测定A.E。

一、原理
样品中维生素D经热皂化处理后。

用HPLC紫外检测，内标法定量。

二、仪器
1、HPLC：water公司，510泵，486紫外检测器，三锐色谱工作站。

2、超声波振荡器
3、水浴箱
4、0.45μ滤膜
三、试剂
1、维生素D3标准对照品：精确称取维生素D3标准对照品（sigma公司）5.0mg 左右加已脱醛处理的无水乙醇至50ml刻度，配成100μg/ml的标准D3贮备液。

2、维生素D贮存一般较稳定，贮备液也可在264μn下按常规的标定方法用比吸光系数计算出维生素D3的标准浓度。

维生素D3比吸光系数E1%cm=493。

3、其他试剂：无水乙醚，无水乙醇，无水硫酸钠，甲醇，抗坏血酸，氢氧化钾，内标苯并e芘……等同GB/T 5009.82-2003或GB/T 5413.9-1997
四、方法
1、准确称取经研碎成粉状的均匀样品2.0g于皂化瓶中，加内标苯并e芘溶液
2.0ml，加10%抗坏血酸5ml，样品先混成均匀的糊状，再加无水乙醇30ml同1：1氢氧化钾溶液10ml在沸水上皂化10分钟，使皂化完全，皂化后立即放入冰中冷却。

2、提取、洗涤、浓缩等步骤同GB/T 5009.82-2003，最后用无水乙醇定容至2ml。

五、色谱条件“
1、流动相：甲醇：水=97.5：2.5
2、分析柱：Kromasil C18 5μ250×4.6mm
3、紫外检测器波长：264nm（如同时测定维生素A.E可依维生素A.D.E的峰时间在325nm→264nm→292nm转换。

4、进样量10μl
5、流速：1.0ml/分钟
六、计算：常规内标法定量
注：本实验条件的出峰和检测波长转换顺序：
检测波长出峰时间
维生素A：325nm 5.80’±
内标苯并e芘：325nm 7.45’±
维生素D3：264nm 17.09’±
维生素E：292nm 19.61’±
叶酸测定方法
一、原理：样品中的叶酸用稀氨水提取，用HPLC反相分离后紫外检测，外标法定量。

二、仪器
1、HPLC：Water 公司.510泵、486紫外检测器、三锐色谱工作站。

2、PH计：ORION SA 720
3、超声波提取器
4、水浴箱
5、0.45μ滤膜
三、试剂
磷酸二氢钾（AR）；氢氧化钾（AR）；氨水（AR）；甲醇（色谱醇）；叶酸标准对照品（sigma公司）纯度＞98%
四、色谱条件“
1、流动相：称取磷酸二氢钾6.8g，氢氧化钾（0.1mol/L）70ml用水稀释到850ml，再用PH计调PH6.3±0.1，用0.45μ滤膜过滤后备用（水相），临用前与甲醇混合，水相：甲醇=87：13，超声脱气为流动相。

2、色谱柱：Kromasil C18 5μ250×4.6mm
3、流速：0.8ml/分钟
4、检测器波长：UV254
5、进样量10μl
五、方法
1、标准配制：准确称取sigma公司叶酸标准对照品10.0mg于50ml容量瓶中加0.5%氨溶液，超声溶解并用0.5%氨溶液稀释至50ml刻度，配成0.2mg/ml的叶酸标准贮备液。

本样品通过预实验配制成合适的叶酸标准进样浓度为5～6μg/ml 于HPLC进样测定，同时记录相应的峰面积。

2、样品提取与测定：准确取均匀研碎的样品粉末约5g(准确至0.001g)于100ml 容量瓶中，加0.5%氨溶液约80ml，超声提取15分钟，再于沸水中加热15分钟，冷却，再用0.5%氨溶液稀释至100ml刻度，摇匀经0.45μ滤膜过滤后，进样于
HPLC检测记录峰面积。

六计算：
样品峰面积×叶酸标准浓度μg/ml×100×1000
叶酸mg/100g=
标准峰面积×样品重量（g）×1000
注：本方法参照中华人民共和国药典2005年版二部P109叶酸片的定量方法。