TSK 色谱柱使用汇总

Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.
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1. 离子交换色谱法(IEC)
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抗体药物分析实例1
TSKgel CM-STAT(4.6mmI.D.x10cm)
色谱条件
80
色谱柱:
TSKgel CM-STAT (4.6mmI.D. x 10cm)
↓ 37℃, 孵化
↓ 每隔一定的时间取样品40μL
↓ 加入10μL, 3mol/L的Tris(阻止酶解反应继续进行)
↓ 加入990μL, 20mmol/L的磷酸缓冲液 + 0.3mol/L的NaCl, pH7.0
↓ 分析
胃蛋白酶(Pepsin): from porcine gastric mucosa, Sigma P7012, 2540Units/mg
: UV (280nm) : 室温 : 10μL
: 0.24g/L
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PEG化蛋白的分析(PEG:5KD)
Mouse IgG1 ( 5g/L, 20mmol/L的磷酸缓冲液 + 0.3mol/L的NaCl, pH7.0 )
↓ 加入2.5, 5, 10倍摩尔量的PEG-NHS/DMF溶液
温度
: 25℃
进样体积 : 20μL
样品浓度 : 0.25g/L
处理流程:
核糖核酸酶A在1%的碳酸铵缓冲液(pH8.2)中溶解配
制成5g/L浓度的溶液，然后在37度下孵化0-192个小时。
孵化完成后，使用20mmol/L的MES(pH6.0)稀释至0.25g/L
的浓度并进行HPLC分析。
核糖核酸酶A及其两种异构体被完全分离。根据孵化
脱酰胺作用并生成2种异构体(Asp67 and iso-Asp67)。
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2. 尺寸排阻色谱法(SEC)
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免疫球蛋白的分离分析
mAU mAU
TSKgel G3000SWXL, TSKgel G4000SWXL
20
14
TSKgel G3000SWXL
・分解（酶的作用・非酶的作用） 蛋白酶的酶解、脱酰胺、氧化等
・其他 化学修饰（PEG化等）、变性、聚合等
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2
背景
蛋白质药物
・抗体药物、重组蛋白等已经被广泛应用于治疗方面。 ・蛋白质差异性的品质管理工作极其重要。 ・聚合物、变性物质等可能会导致过敏性休克或免疫 反应，所以对于它们的分析研究也是非常重要的。
30
C
检测 温度
: UV (280nm) : 25℃
20
进样体积 : 20μL
B
样品浓度 :0.5g/L
10
样品:
A; humanized, IgG1
A
B; humanized, IgG1
0
C; chimera, IgG1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
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胃蛋白酶酶解抗体的过程跟踪
TSKgel G3000SWXL
色谱条件
色谱柱 流动相 流速 检测 温度 进样体积 样品浓度
: TSKgel G3000SWXL (7.8mmI.D. x 30cm) : 20mmol/L Phosphate + 0.3mol/L NaCl (pH7.0)
10% B
20
KK
15
K
流速 检测 温度
: 1.0mL/min
: UV (280nm) : 25℃
进样体积 : 20μL
10
样品浓度 :0.5g/L
5
处理前
样品:经羧肽酶B处理和未经羧肽酶处理的治疗性抗体药物
0
处理流程:
-50
1
2
3
4
5
6
78
min
9
在35uL的治疗性抗体(10mg/mL)中加入1uL的羧肽酶 10 11 12 13 14 15 B(Sigma C9584, 140U/mg protein, 5g/L in PBS)，37度下孵
流动相:
A: 20mmol/L MES pH6.0
B: 20mmol/LMES 1mol/L NaCl pH6.0
梯度:
B%:5%(0min)-25%(30min)-100%(30min)-
100%(34min)-5%(34min)-5%(40min)
流速
: 1.0mL/min
检测
: UV (280nm)
↓ 4℃, 孵化17小时
↓ 取100μL的样品溶液并加入900μL, 20mmol/L的磷酸缓冲液
+ 0.3mol/L的NaCl, pH7.0 ↓
分析
PEG-NHS：PEG, N-hydroxysuccinimidyl ester SUNBRIGHT ME-050CS, M.W.:5000, NOF CORPORATION, JAPAN
↓ 加入木瓜蛋白酶(Papain)溶液10vol% ( 1g/L, 10mmol/L的磷酸缓冲液, pH7.3 + 0.15mol/L的NaCl + 1mmol/L EDTA・2Na + 25mmol/L β-mercaptoethanol )
↓ 37℃, 孵化
↓ 每隔一定的时间取样品48.5μL
↓ 加入1.5μL, 1mol/L的碘乙酰胺(阻止酶解反应继续进行)
时间与核糖核酸酶A峰面积作图，并推断出在1%的碳酸铵
缓冲溶液(pH8.2)条件下，核糖核酸酶A的半衰期大约为
180个小时。
天冬酰胺(Asp)
天冬酰胺(Asp)
琥珀酰亚胺中间体 异天冬酰胺(isoAsp)
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备注: 核糖核酸酶A在中等碱性条件下可以引起Asn67位点
化3个小时。然后加入664uL的20mmol/L的MES(pH6.0)以将
抗体样品浓度稀释至0.5g/L。最后取20uL的稀释样品进样。
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核糖核酸酶A脱酰胺化的过程跟踪
mAU
TSKgel CM-STAT(4.6mmI.D.x10cm)
: 20mmol/L phosphate buffer + 0.3mol/L NaCl (pH7.0)
: 0.35mL/min
: UV (280nm) : 室温 : 5μL : 人单克隆抗体(4.6g/L, IgG1)
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抗体(IgG)的结构
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TSKgel G4000SWXL
18
12
16
11
14
10
12
HSA
9
8
HSA
10
Transferrin
7
Transferrin
6
8
5
IgG
IgG
6
4
4
IgA
2
IgM
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
min
3
IgA
2
1
IgM
0
-1 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0
: 1.0mL/min
: UV (280nm) : 室温 : 10μL
: 0.19g/L
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木瓜蛋白酶酶解抗体的过程跟踪
Mouse IgG1 ( 5g/L, 10mmol/L的磷酸缓冲液, pH7.3 + 0.15mol/L的NaCl + 1mmol/L EDTA・2Na + 25mmol/L β-mercaptoethanol )
min
色谱条件
色谱柱: TSKgel G3000SWXL (7.8mmI.D. x 30cm) TSKgel G4000SWXL (7.8mmI.D. x 30cm)
流动相: 20mmol/L Phosphate buffer + 0.3mol/L NaCl (pH7.0) 流速: 0.5mL/min 检测: UV (280nm) 温度: 25℃
木瓜蛋白酶 酶切位点
胃蛋白酶 酶切位点
Fab Fc
F(ab’)2
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胃蛋白酶酶解抗体的过程跟踪
Mouse IgG1 (5g/L,0.1mol/L的柠檬酸缓冲液, pH3.7)
↓ 加入胃蛋白酶(Pepsin) 40U/mg-IgG (1g/L,0.1mol/L的柠檬酸缓冲液, pH3.7)
蛋白质异构体的HPLC分析
～TSK-GEL色谱柱的应用总结～
东曹（上海）生物科技有限公司 Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.
2012.01
Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.
1
背景
关于蛋白质的差异性(不均一性)
・翻译后的修饰（酶的作用等） 磷酸化（脱磷酸化）、糖基化、脂质化、甲基化、 乙酰化、多肽部分的酶切等
流动相:
A; 20mmol/L MES (pH6.0)
70
B; 20mmol/L MES + 500mmol/L NaCl (pH6.0)
梯度:
0min
10% B
60
15min
30% B
50
E
15.1min 100% B
18min
100% B
18.1min 10% B
40
D
23min
10% B
流速
: 1.0mL/min
8
1:核糖核酸酶A(RNaseA)
7 2,3:脱酰胺后的异构体
6
2
3
5
4
3
2
1
0
1
192h 96h 48h 24h 0h
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
minTSKgel CM-STAT (4.6mmI.D. x 10cm)
进样体积: 15μL 进样浓度: 0.17g/L 样品: 1. Human IgM (from myeloma, M.W.:970kDa)
2. Human IgA (colostrum,,M.W.:390kDa) 3. Human IgG (M.W.:150kDa) 4. Transferrin (M.W.:80kDa) 5. Human serum albumin (M.W.:66kDa)
↓ 37℃, 15分钟
↓ 加入950μL, 20mmol/L的磷酸缓冲液 + 0.3mol/L的NaCl, pH7.0
↓ 分析
木瓜蛋白酶(Papain): from papaya latex Sigma P4762, 14Units/mg protein
Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.
流动相:
A; 20mmol/L MES (pH6.0)
45
B; 20mmol/L MES + 500mmol/L NaCl (pH6.0)
40
梯度:
0min
10% B
15min
30% B
35
15.1min 100% B
30
经羧肽酶B处理后
18min 18.1min
100% B 10% B
25
23min
min
D; chimera, IgG1 E; chimera, IgG1
mAU
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6
抗体药物分析实例2
TSKgel CM-STAT(4.6mmI.D.x10cm)
mAU
55
色谱条件
50
色谱柱:
TSKgel CM-STAT (4.6mmI.D. x 10cm)
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10
抗体二聚体的分析
TSKgel SuperSW3000
monomer(150kDa)
dimer(300kDa)
色谱条件
色谱柱 流动相 流速 检测 温度 进样体积 样品
: TSKgel SuperSW3000 (4.6mmI.D. x 30cm)
基础研究・医药品等的研发
・翻译后修饰与分解物的分离分析是必要的。 ・不仅是蛋白质，DNA、RNA、多肽类药物的研发也同 样需要进行此类分析工作。
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3
常用的HPLC分析模式
1. 离子交换色谱法 (IEC) 2. 尺寸排阻色谱法 (SEC) 3. 疏水相互作用色谱法 (HIC)
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木瓜蛋白酶酶解抗体的过程跟踪
TSKgel G3000SWXL
色谱条件 色谱柱 流动相 流速 检测 温度 进样体积 样品浓度
: TSKgel G3000SWXL (7.8mmI.D. x 30cm) : 20mmol/L Phosphate + 0.3mol/L NaCl (pH7.0)
: 1.0mL/min