温敏性壳聚糖凝胶的流变学表征

中国修复重建外科杂志2008年7月第22卷第7期·861·温敏性壳聚糖凝胶的流变学表征
张雪雁 朱彬 顾其胜
【摘 要】 目的 研究壳聚糖（chitosan，CH）脱乙酰度（degree of deacetylation，DDA）对CH-甘油磷酸盐温控
体系凝胶化行为的影响，同时比较其在凝胶形成前后的流变学行为差异。

 方法 将DDA为70%、85%、90%和97%
的CH粉末分别溶解于0.1 mol/L的盐酸溶液，制备各DDA浓度为2%（w/v）的CH溶液样品，每种DDA制备5个样品，于10℃下与五水甘油磷酸钠（β-glycerol phosphate disodium salt pentahydrate，GP）溶液混匀后，得到不同DDA的CH-GP温敏溶液。

用AR 2000ex流变仪在pH7.02条件下分别对CH-GP溶液和凝胶进行流变学以及物理性质表征测定。

 结果pH7.02条件下，DDA分别为85%、90%及97%的CH-GP温敏溶液，其初始凝胶化温度分别为（59.90 ± 0.08）、（48.10 ± 0.08）、（37.10 ± 0.11）℃，凝胶化时间分别为（12.4 ± 0.6）、（8.2 ± 0.5）、（4.9 ± 0.1）min；DDA为70%的CH-GP溶
液凝胶化温度超过70℃，凝胶化时间超过15 min。

各DDA的CH样品凝胶化温度和凝胶化时间比较差异均有统计学意
义（P < 0.05）。

CH-GP体系形成凝胶前，储能模量（G'）和耗能模量（G''）最初均随频率升高而上升，至凝胶化温度点时
2条曲线交汇，之后G'显著升高，G''则缓慢下降。

形成凝胶后，随着频率升高，G'和G''均无明显改变。

 结论 流变学
表征可客观测定CH-GP体系的凝胶化温度以及凝胶的力学性能，因而这种方法在组织工程设计用于不同目的的支架时，有助于针对不同靶向组织选择合适DDA的CH原料。

【关键词】 壳聚糖 甘油磷酸盐 温敏凝胶 流变学表征
中图分类号： R318.08 Q66 文献标志码：A
EFFECT OF DEACETYLATION DEGREE OF CHITOSAN ON THERMOSENSITIVE HYDROGEL VIA RHEOLOGICAL CHARACTERIZATION/ ZHANG Xueyan, ZHU Bin, GU Qisheng. Shanghai Qisheng Institute of Biomaterial & Technology, Shanghai, 201106, P.R.China. Corresponding author: GU Qisheng, E-mail: qish@
【Abstract】Objective To evaluate the effect of deacetylation degree(DDA)on the gelation behavior of thermo-sensitive chitosan-βglycerol phosphate disodium salt pentahydrate(CH-GP)system and to compare their rheological behaviors before and after gelation.Methods A series of thermosensitive CH-GP samples with different DDAs(70%,85%,90%,97%) were prepared by dissolving CH with0.1mol/L HCl solution,5samples for every single DDA,and then all these CH-GP solution samples processed the frequency sweep test and temperature sweep test(10-70℃,1℃/min)on AR2000ex rheometer,with pH value of7.02.Also,all the results of hydrogel samples were processed a frequency sweep test. Results With CH concentration
of2%(w/v)and pH value of7.02,the gelating temperature of CH-GP systems with different DDAs(85%,90%,97%)were (59.90±0.08),(48.10±0.08),(37.10±0.11)℃,respectively.While the gelating temperature of CH-GP system with70% DDA was over70℃. There were statistically significant differences in temperature and time of gelation among groups with different DDAs(P <0.05).Furthermore,storage modulus of such system raised from dozens Pa to a magnitude of several kPa during gelation,while loss modulus kept almost steady.Conclusion Gelating temperature and mechanical property of the system could be measured objectively by rheological characterization.Thus during designing tissue engineered scaffolds for various purposes,it is helpful applying selected CH with optimal DDA to different target tissues.
【Key words】 Chitosan Glycerolphosphate Thermosensitive hydrogel Rheological characterization
智能水凝胶是三维高分子网络与溶剂水相互作用形成的体系，该体系可响应外界环境改变，如pH值、温度、磁场强度等而发生形态改变[1-3]。

根据凝胶形成机制的不同，智能水凝胶可分为物理水凝胶和化学水凝胶。

与化学交联结构相比，物理水凝胶因不需加入化学分子交联剂，具有毒性及刺激性小的优点。

壳聚糖（chitosan，CH）-甘油磷酸盐体系以大分子多糖CH为
作者单位：上海其胜生物材料技术研究所（上海，201106）
通讯作者：顾其胜，研究员，博士导师，研究方向：天然降解生物材料，E-mail: qish@ 基质，辅以甘油磷酸盐作为促凝剂，这种可在体温37℃原位形成凝胶的智能体系在再生医学和组织工程学应用方面引人注目[4-9]，如注射填充不规则形状的腔隙或常规器械难以到达的部位，作为药物载体和基因载体等[10-12]。

CH脱乙酰度（degree of deacetylation，DDA）是影响其凝胶化过程的一个重要参数，我们在CH浓度均为2%（w/v）、加入五水甘油磷酸钠（β-glycerol phos-phate disodium salt pentahydrate，GP）调节最终pH7.02的条件下，就CH不同DDA对CH-GP体系凝胶化温度和凝胶化时间的影响，进行研究讨论。

Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, July 2008, V ol. 22, No.7·862·
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 
DDA分别为70%、85%、90%和97%的CH（大连鑫蝶甲壳素有限公司）；浓盐酸（宜兴市第二化学试剂厂）；GP粉末（ Fluka Biochemika公司，瑞典）。

AR 2000ex流变仪（TA公司，美国）；AL204电子天平（Mettler-Toledo公司，美国）；DK-8A电热恒温水浴槽（上海医用恒温设备厂）；PHS-25型pH计（上海雷磁仪器厂）。

1.2 CH-GP温敏溶液的制备
CH溶液的配制：分别将DDA为70%、85%、90%和97%的CH粉末溶解于0.1 mol/L的盐酸溶液，得到4种2%（w/v）的CH溶液，每种5个样品。

于25℃搅拌过夜至完全溶解，以150目绢丝过滤，除去杂质后，滤液静置，待气泡除去后，于10℃保存备用。

GP溶液的配制：称取适量GP粉末，溶解于新鲜蒸馏水，完全溶解后，得到浓度为0.8 g/mL的GP溶液，于10℃保存备用。

CH-GP温敏溶液的制备：于10℃将GP溶液分别逐滴加入4种CH溶液中，每加入1滴GP溶液，搅拌混匀，待pH稳定后再继续滴加，至pH值为7.02。

得到由4种不同DDA的CH制备的温敏溶液，每种5个样品。

将最终得到的CH-GP温敏溶液于10℃保存备用。

1.3 检测指标
1.3.1 CH-GP温敏溶液凝胶化温度比较 采用AR 2000ex流变仪对CH-GP温敏溶液样品进行流变学中的温度扫描测定。

用20 mm平板几何测头于10～70℃范围内缓慢上升温度，升温速率为1℃/m in，得到储能模量（G'）和耗能模量（G''）变化曲线，当G'和G''均符合一条力学定律（G' ∝ωn，G''∝ ωn），且n值相同时，该温度为凝胶化温度[13-14]。

在pH7.02条件下，分别测定各CH-GP温敏溶液的凝胶化温度，并进行比较。

每种DDA的CH样品均进行5次实验，取平均值。

1.3.2 CH-GP温敏溶液的流变学表征 在1.3.1描述的温度扫描测定过程中，升温前用AR 2000ex流变仪分别对4种CH-GP温敏溶液样品进行流变学测定。

用20 mm平板几何测头进行频率扫描，得到G'和G''变化曲线；升温过程结束后CH-GP温敏溶液完全凝胶化，分别对4种最终形成的凝胶进行频率扫描，比较凝胶形成前后流变学数据。

每个样品检测3次，观察实验重复性，结果取平均值。

1.4 统计学方法
采用SPSS14.0统计软件包进行分析。

数据以均
数 ± 标准差表示，组间比较采用配对t检验，P值< 0.05为有统计学意义。

2 结果 
2.1 CH-GP温敏溶液凝胶化温度比较 
在CH浓度为2%（w/v）和pH7.02条件下，DDA 分别为85%、90%及97%的CH-GP温敏溶液初始凝胶化温度分别为（59.90 ± 0.08）、（48.10 ± 0.08）、（37.10 ± 0.11）℃，凝胶化时间分别为（12.4 ± 0.6）、（8.2 ± 0.5）、（4.9 ± 0.1）min；而DDA为70%的CH-GP温敏溶液初始凝胶化温度超过70℃，凝胶化时间超过15 min。

各DDA的CH样品凝胶化温度和凝胶化时间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。

DDA为85%、90%和97%的CH-GP体系在10～70℃的升温凝胶化过程中G'和G''的变化曲线见图1。

2.2 CH-GP溶液的流变学表征
形成凝胶前，G'和G''最初均随频率升高而上升，至凝胶化温度时2条曲线交汇，之后G'显著升高，G''则缓慢下降（图2 a）。

形成凝胶后，随着频率升高，G'和G''均无明显改变（图2 b）。

3 讨论
有研究者通过肉眼判断溶液流动性的方法测定CH-GP溶液凝胶化温度[15-17]，即在某个特定温度下，将装有溶液的试管倒置，观察是否有流动性，如果凝固不流动，该温度即为凝胶化温度。

这种方法主观影响因素大，可靠度不高。

我们用AR 2000ex流变仪测定CH-GP温敏溶液10～70℃G'和G''的实时值，绘制曲线，当G'曲线偏离G''曲线急剧升高的温度点，即判定为凝胶化温度[13-14]。

该法与肉眼观测法相比，客观可靠。

实验结果表明，在最终pH相同、起始CH浓度相同的条件下，凝胶化温度随着DDA升高而降低，与其他文献报道的结果一致[4-7，14，18]。

CH在酸性溶液中的溶解度很大程度上依赖于其DDA大小，DDA低的CH溶于酸后形成的溶液由于含乙酰基较多，可发生质子化形成的氨基较少[13，18]，可吸附的阴离子少，加入甘油磷酸盐后形成交联的速度较慢，需要从环境中吸收更多的热量来形成氢键等作用，所以在较高的水浴温度下才能形成凝胶；而DDA较高的CH，溶于酸后形成大量被质子化的氨基，可吸附大量阴离子，加入GP 后形成交联的速度较快，并且只需要较少的热量就能形成凝胶。

温敏凝胶转变前后的G'和G''图表明，在低温下，当体系受到外部剪切应力时，马上传递力作用，剪切应力增加时，对外做功也升高，交汇点时G'和G''值相等
中国修复重建外科杂志2008年7月第22卷第7期·863·
达到瞬间平衡，而当频率升到一定值时，体系对外部做功减少，说明该体系仍保持为溶液状态，表现出液体特有的流变性；保持在一定水平，即当外力对该体系做功时，并无明显的力传递作用，说明溶液已经转变为凝胶，应变比溶液体系显得迟钝。

组织工程和再生医学应用中，CH-GP温敏凝胶体系可作为药物或基因载体、组织工程支架以及软组织修复填充物等[5-9，14，19]，在不同部位组织中，需要具备不同的力学性能和近体温的凝胶化温度，才能“因地制宜”地发挥预期效用。

BioSyntech公司开发的BST-InPod 系列产品，将CH-GP温敏凝胶体系注射入足底脂肪层，使其与患者自体脂肪融合以减缓足底疼痛，此时就需要形成硬度较低的凝胶，在组织工程设计中，可考虑选择DDA不太高的CH原料。

而对于注射后原位形成凝胶而言，凝胶化温度接近体温就相当重要[7，9，14，20-21]。

因此，用流变学表征法测定凝胶化温度，以及检测凝胶的力学性能，对于人们在组织工程研发和设计过程中，选择合适DDA的CH作为原料，得到具备预期力学性能和近体温的凝胶化温度而言，具有重要意义。

4 参考文献 
1 向远清,陈大俊.快速响应智能水凝胶的研究进展.化学世界,2006,
47(5):308-310.
2张明,陈明清,刘晓亚,等.聚合物凝胶的研究与应用.化学世界, 2002,43(9):498-501.
3Ruel-Gariépy E,Shive M,Bichara A, et al.A thermosensitive chitosan-based hydrogel for the local delivery of paclitaxel.Eur J Pharm Bio-pharm,2004,57(1):53-63.
4Chenite A,Chaput C,Wang D, et al.Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ.Biomaterials,2000,21(21): 2155-2161.
5 Hsu SH,Whu SW,Tsai CL, et al.Chitosan as scaffold materials:effects
of molecular weight and degree of deacetylation.J Polym Res,2004,11: 141-147.
6Griffon DJ,Sedighi MR,Schaeffer DV, et al.Chitosan scaffolds:inter-
connective pore size and cartilage engineering.Acta Biomater,2006, 2(3):313-320.
7Ruel-Gariepy E,Chenite A,Chaput C, et al.Characterization of ther-mosensitive chitosan gels for the sustained del ivery of drugs.Int J Pharm,2000,203(1-2):89-98.
8李忠,杨柳,戴刚,等.骨髓间充质干细胞在壳聚糖凝胶中体外三维培养的实验研究.四川医学,2006,27(12):1211-1212.
9 王芹,李程,陈雪梅,等.快速凝胶化温敏型壳聚糖/甘油磷酸盐凝胶
及释药性能.中国医学工程,2007,15(6):465-472.
10 魏宏亮,王连才,张爱英,等.可注射水凝胶的制备与应用.化学进
展,2004,16(6):1008-1016.
11Berrada M,Serreqi A,Dabbarh F, et al.A novel non-toxic camptoth-ecin formulation for cancer chemotherapy.Biomaterials,2005,26(14): 2115-2120.
12Ruel-Gariepy E,Shive M,Bichara A, et al.A thermosensitive chitosan-based hydrogel for the local delivery of paclitaxel.Eur J Pharm Bio-pharm,2004,57(1):53-63.
13 Chenite A,Buschmann M,Wang D, et al.Rheological characterisation
of thermogelling chitosan/glycerol-phosphate solutions.Carbohydrate Polymers,2001,46:39-47.
14Chenite A,Chaput C,Wang D, et al.Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ.Biomaterials,2000,21(21): 2155-2161.
15 吴燕,成国祥,曲波.透明温敏性羧甲基壳聚糖配合物凝胶的制备.
高分子材料科学与工程,2006,22(3):223-226.
16Wu J,Su ZG,Ma GH.A thermo-and pH-sensitive hydrogel composed of quaternized chitosan/glycerophosphate.Int J Pharm,2006,315(1-2): 1-11.
17Wu J,Wei W,Wang LY, et al.A thermosensitive hydrogel based on quaternized chitosan and poly(ethylene glycol)for nasal drug delivery system.Biomaterials,2007,28(13):2220-2232.
18 Ganji F,Abdekhodaie MJ,Ramazani SA.Gelation time and degadation
rate of chitosan-based injectable hydrogel.J Sol-Gel Sci Techn,2007, 42:47-53.
19 井波,王志强.温敏性壳聚糖水凝胶研究进展.国际骨科学杂志,
2006,27(2):115-116.
20Hoemann CD,Sun J,Legare A, et al.Tissue engineering of cartilage using an injectable and adhesive chitosan-based cell-delivery vehicle.
Osteoarthritis Cartilage,2005,13(4):318-329.
21Hoemann CD,Hurtig M,Rossomacha E, et al.Chitosan-glycerol phos-phate/blood implants improve hyaline cartilage repair in ovine micro-fracture defects.J Bone Joint Surg(Am),2005,87(12):2671-2686.
 （收稿：2007-10-26 修回：2008-02-20）
（本文编辑：刘丹）
图1 各DDA的CH-GP体系在10～70℃升温凝胶化过程中G'（红色）和G''（蓝色）的变化曲线 图2 DDA为85%的CH-GP溶液形成凝胶前后的G'
（ 红色）和G''（蓝色）变化曲线
 形成凝胶前
 形成凝胶后
Fig.1 Storage modulus (G', red) and loss modulus (G'', blue) changing curve of CH-GP system during gelation with temperature raisng from 10 to
70℃Fig.2
Storage modulus (G', red) and loss modulus (G'', blue) changing curve of CH-GP system with a DDA of 85%
Before gelation After
gelation
℃。