五子衍宗方对环磷酰胺致小鼠DNA损伤的影响

五子衍宗方对环磷酰胺致小鼠DNA损伤的影响
目的观察五子衍宗方对环磷酰胺（CTX）致小鼠DNA损伤的影响，并探讨其作用机制。

方法将BalB/c小鼠随机分为正常组、模型组、五子衍宗方低剂量组、五子衍宗方高剂量组。

五子衍宗方低、高剂量组预给药1周后，除正常组外，其余各组腹腔注射CTX 100 mg/kg造模，隔日1次，共3次，同时五子衍宗方低、高剂量组继续给药，末次给予CTX后12 h处死小鼠，分离血清，ELISA 检测血清中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量，应用单细胞凝胶电泳技术检测骨髓细胞DNA损伤。

结果五子衍宗方低、高剂量组能够降低血清中8-OHdG 的含量，使小鼠骨髓细胞彗星图像的Olive尾矩、尾距、尾长和尾部DNA含量降低。

结论五子衍宗方对CTX致小鼠DNA损伤具有较好的保护作用。

Abstract：Objective To study protective effects of Wuzi Yanzong Fang on DNA damage induced by cyclophosphamide （CTX）in mice，and explore its mechanism. Methods BalB/c mice were randomly divided into normal group，model group，Wuzi Yanzong Fang low dose group and Wuzi Yanzong Fang high dose group. Mice in Wuzi Yanzong Fang groups were pretreated with Wuzi Yanzong Fang for 7 days，then the mice in Wuzi Yanzong Fang groups and model group were intraperitoneally injected with CTX （100 mg/kg）every other day for three times，and mice in Wuzi Yanzong Fang groups were continued administered with Wuzi Yanzong Fang. Animals were sacrificed in twelve hours after the final treatment of CTX. ELISA was used to detect 8-OHdG content in serum，and single cell gel electrophoresis to detect DNA damage in bone marrow cells. Results Wuzi Yanzong Fang low dose group and high dose group reduced the level of 8-OHdG in serum. Wuzi Yanzong Fang significantly decreased Olive tail moment，tail moment，tail length and tail DNA% in mouse bone marrow cells. Conclusion Wuzi Yanzong Fang has good protective effects on DNA damage caused by CTX.
Key words：Wuzi Yanzong Fang；cyclophosphamide；DNA damage；mice
环磷酰胺（CTX）是目前临床上常用的烷化剂类抗肿瘤药，也是一种免疫抑制剂，常用于治疗白血病、淋巴瘤和乳腺癌等多种恶性肿瘤。

然而，CTX在抑制肿瘤细胞增殖的同时，对正常细胞具有细胞毒性，CTX代谢产物能够和大分子如蛋白质、RNA、DNA结合，导致DNA损伤，从而引起骨髓抑制、生殖毒性等不良反应。

CTX的临床疗效也因此而被限制，故减少CTX在临床应用中的不良反应非常重要。

本实验观察五子衍宗方对CTX致小鼠DNA损伤的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料
1.1 动物
40只8～9周龄SPF级BalB/c种小鼠，体质量22～25 g，湖北省实验动物
中心提供，动物许可证号：SCXK（鄂）2008-0005。

分笼饲养，湿度55%～65%，环境温度（20±2）℃，12 h光照，啮齿类动物饲料喂养，自由饮水。

1.2 药物
五子衍宗方由枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、五味子组成，原药材经三峡大学汪均植教授鉴定为正品。

按照传统方法煎取，浓缩至粉末，提取率为18.8%，临用前配成相应浓度的溶液。

CTX购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号13030425。

1.3 主要试剂与仪器
正常熔点琼脂糖（NMA），低熔点琼脂糖（LMA），肌氨酸钠，TritionX-100，溴化乙锭（EB），二甲亚砜（DMSO），三羟甲基氨基甲烷（Tris-base），乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）。

稳流可调式电泳仪（北京六一仪器厂），BX51型Olympus 荧光显微镜（日本）。

2 实验方法
2.1 分组、造模与给药
将小鼠随机分为正常组、模型组、五子衍宗方低（100 mg/kg）剂量组、五子衍宗方高（200 mg/kg）剂量组，每组8只。

五子衍宗方低、高剂量组预给药1周后，除正常组外，其余各组腹腔注射CTX 100 mg/kg造模，隔日1次，共3次，同时五子衍宗方低、高剂量组小鼠按照0.1 mL/kg继续给药。

2.2 指标检测
2.2.1 血清中8-羟基脱氧鸟苷测定末次给予CTX后12 h处死小鼠，眼球取血后静置30 min，3500 r/min离心10 min，分离血清，ELISA测定血清中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量。

2.2.2 碱性单细胞凝胶电泳取出股骨，用PBS冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，过滤，用PBS洗涤2次后，悬浮于PBS中，用细胞计数板计数，将细胞悬液调整至细胞密度为1×106个/mL。

在普通载玻片上用玻璃胶粘上小玻璃条，用PBS 配制1%的正常熔点琼脂糖，煮沸后取100 μL均匀铺在载玻片上，置于4 ℃，固化5 min即第1层胶，取100 μL于37 ℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖，与100 μL骨髓细胞悬液充分混匀后加入第1层胶上，置于4 ℃，固化5 min即第2层胶。

将载玻片浸入新鲜配制的4 ℃的碱性裂解液，4 ℃冰箱内避光裂解2 h。

将载玻片从裂解液中取出，用蒸馏水轻轻冲去多余的盐分，将凝胶载玻片放入电泳槽中，加入4 ℃冰箱预冷的电泳液至盖过胶面2～3 cm，避光静置4 ℃解旋20 min。

调节电泳仪至电压25 V、电流300 mA，4 ℃避光电泳20 min。

电泳结束后，将凝胶载玻片从电泳槽中取出，浸入pH 7.0 Tris-HCl中和液中，每5 min换液1次，中和20 min。

在凝胶上滴加溴化乙锭（10 μg/L）100 μL，2 min 后用蒸馏水洗涤2次，稍微晾干，尽快在荧光显微镜下进行观察。

将染色好的载玻片放在荧光显微镜的40倍镜下观察拍照，采用Casp1.2.3彗星分析软件对彗星
图像进行分析。

选取彗星图像的Olive尾矩、尾距、尾长和尾部DNA含量进行分析。

3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。

实验数据均以—x±s表示，多组间差异比较采用方差分析，以Dunnet-t检验比较2组间均数的差异。

P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果
4.1 五子衍宗方对小鼠血清中8-羟基脱氧鸟苷的影响
5 讨论
CTX是临床常用的广谱抗肿瘤药物和免疫抑制剂。

CTX在体外无活性，进入体内后可以通过肝脏细胞色素p-450B和p-450C单加氧酶催化，经过一系列变化生成磷酰胺氮芥和丙烯醛。

磷酰胺氮芥能与细胞内的大分子如蛋白质、DNA、RNA发生烷化作用，形成DNA链内和链间的交叉联结，从而干扰体内细胞的分裂增殖[1]。

另一方面，CTX代谢过程中会产生大量活性氧自由基，自由基中有极为活泼的单电子，与亲核性的DNA结合，产生DNA-DNA或DNA-蛋白质的交联，还会与DNA碱基和脱氧核糖发生化学变化，引起脱氧核糖分解、磷酸二脂键断裂、碱基降解、氢键破坏、引起单双链的断裂[2]。

机体DNA一旦发生损伤，会通过阻滞细胞周期修复受损的DNA，不能修复的DNA则走向程序性死亡，从而有效识别和清除DNA损伤。

DNA损伤如果没有即时得到修复，损伤的积累将会导致机体神经退行性病变、衰老等疾病的发生，严重威胁人类的健康[3]。

8-OHdG是DNA氧化损伤的产物，常用来作为DNA的氧化损伤和突变的标志物。

体内活性氧自由基如超氧阴离子、羟自由基等会攻击DNA的鸟嘌呤碱基的第8位碳原子，生成氧化性的加合物8-OHdG，生成的8-OHdG与腺嘌呤A配对，使DNA链的空间结构和碱基配对发生改变，从而引起DNA的突变[4]。

单细胞凝胶电泳技术是目前广泛应用的检测DNA损伤技术，可用于各种细胞及组织的单细胞水平的DNA链断裂的研究。

当外界因素造成DNA损伤时，细胞膜和核膜在裂解液的作用下被去除，蛋白质、RNA及其他成分在高盐溶液的作用下扩散到裂解液中，只有核DNA由于分子量太大留在原位。

在碱性电泳液中电泳，DNA未损伤则无拖尾现象，经荧光染色后呈圆形；若细胞DNA损伤，DNA双链解旋变成单链，损伤的DNA的单链及其碎片会向阳极迁移，形成拖尾，经荧光染色后形成形似彗星的图像。

DNA损伤越严重，产生的片段越小，碎片越多，彗星尾部越长，亮度越亮。

通过定量分析可判断DNA是否损伤及损伤程度[5-6]。

本实验结果表明，当给予CTX后，小鼠血清中8-OHdG含量显著增加，五子衍宗方组能显著降低模型小鼠8-OHdG含量，表明五子衍宗方能够减轻CTX
引起的小鼠DNA的氧化损伤。

同时我们通过单细胞凝胶电泳实验发现，与正常组比较，模型组DNA含量、尾距、尾长几个指标均显著增加，而五子衍宗方各组都对DNA有保护作用，表明五子衍宗方能够显著保护骨髓细胞的DNA免受CTX损伤。

综上所述，五子衍宗方能够抑制CTX引起的DNA损伤，促进损伤的DNA 修复。

其机制可能与五子衍宗方提高机体的抗氧化能力、清除CTX代谢过程中产生的自由基及增强损伤DNA修复的能力有关。

参考文献：
[1] Zhang QH，Wu CF，Duan L，et al. Protective effects of total saponins from stem and leaf of Panax ginseng against cyclophosphamide-induced genotoxicity and apoptosis in mouse bone marrow cells and peripheral lymphocyte cells[J]. Food and Chemical Toxicology，2008，46（1）：293-302.
[2] 杨明建，孔福全，展永，等.各种自由基清除剂在γ射线辐照DNA损伤中的作用[J].核技术，2007，30（4）：255-258.
[3] 宋宜，孙志贤.DNA双链断裂损伤反应及它的医学意义[J].生物化学与生物物理进展，2001，34（9）：929-934.
[4] 朴恩谊，徐立红.8-OHdG在医学领域的应用与研究进展[J].中国细胞生物学学报，2012，34（5）：493-499.
[5] 宋超，贾旭淑，陈家长.单细胞凝胶电泳检测镉对中华倒刺鲃肝细胞DNA 的损伤[J].江苏农业科学，2013，41（1）：275-277.
[6] 陈晓白，王晓平，黄小婷.应用单细胞凝胶电泳技术评价牛大力的遗传毒性[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（12）：222-224.。