谷氨酰胺对脓毒血症大鼠肠淋巴液抑制RAW264.7细胞分泌功能作用的影响

谷氨酰胺对脓毒血症大鼠肠淋巴液抑制RAW264.7细胞分泌
功能作用的影响
梁梦凡;王学敏;薛瑛;江伟
【摘要】Objective To investigate the effects of intravenous administration of glutamine ( Gln) on secretion suppression of RAW 264.7 cells induced by mesenteric lymph in rats with sepsis. Methods SD rats were randomized into sham-operation group (Sham group), sepsis group (CLP group) and Gln group, with 10 rats in each group. Sepsis model was established by cecal ligation and puncture in CLP group and Gln group. Within 10 minutes after model establishment, 0. 75 g/kg Gin was administered via single tail-vein injection in Gln group, while the same amount of normal saline was administered in Sham group and CLP group. Mesenteric lymph was obtained from 5 rats in each group, and blood samples were taken from the other rats 6 h after model establishment in each group. RAW264.
7 cells were incubated with lymph for 4 h in each group, and the supernatants were harvested. The concentrations of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 ( IL-6) in mesenteric lymph and supernatants were measured by ELISA, and the concentrations of Gln in mesenteric lymph and D-lactate in plasma were determined by spectrophotometric assay. Results The concentrations of TNF-a and IL-6 in mesenteric lymph in CLP group and GLN group were significantly higher than those in Sham group (P < 0. 05) . The concentrations of TNF-a and IL-6 in supernatants in CLP group were significantly lower than those in sham group (P < 0. 05) ,
while the concentration of TNF-a in supernatants in Gln group was significantly higher than that in CLP group (P <0. 05) . There was no significant difference in the concentrations of Gln in mesenteric lymph among three groups (P > 0. 05) . The concentration of D-lactate in plasma in Gln group was significantly lower than that in CLP group (P < 0. 05) . Conclusion Secretion of RAW264. 7 cells activated by LPS can be suppressed by mesenteric lymph in rats with sepsis, which can be partially alleviated by Gln treatment.%目的研究静脉注射谷氨酰胺(Gln)对脓毒血症大鼠肠淋巴液抑制RAW264.7细胞分泌功能作用的影响.方法将SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、脓毒血症组(CLP)和Gln组,每组10只.取CLP组和Gln组大鼠,以盲肠结扎穿孔法制备脓毒血症模型,术后10 min内Gln组经尾静脉注射Gln 0.75 g/kg,Sham组和CLP组注射等量生理盐水.各组分别取5只大鼠引流肠淋巴液,另5只于术后6h时采集血样.将各组淋巴液分别与RAW264.7细胞共孵育4h,收集培养上清液.ELISA法测定肠淋巴液和细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的浓度,比色法检测肠淋巴液Gln及血浆D-乳酸浓度.结果 CLP组和Gln组肠淋巴液中TNF-α和IL-6的含量均明显高于Sham组(P＜0.05)；CLP组细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的浓度显著低于Sham组(P＜0.05),而Gln组细胞培养上清液中TNF-α浓度显著高于CLP组(P＜0.05).三组肠淋巴液中Gln浓度比较差异均无统计学意义(P＞0.05).Gln组血浆中D-乳酸浓度明显低于CLP组(P ＜0.05).结论脓毒血症大鼠肠淋巴液对LPS激活后的RAW264.7细胞分泌功能有明显抑制作用,Gln能部分减轻该抑制作用.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2012(032)011
【总页数】4页(P1472-1475)
【关键词】谷氨酰胺;脓毒血症;肠淋巴液;巨噬细胞;肿瘤坏死因子α;白介素6
【作者】梁梦凡;王学敏;薛瑛;江伟
【作者单位】上海交通大学附属第六人民医院麻醉科/ICU,上海200233;上海交通
大学附属第六人民医院麻醉科/ICU,上海200233;上海交通大学附属第六人民医院
麻醉科/ICU,上海200233;上海交通大学附属第六人民医院麻醉科/ICU,上海200233
【正文语种】中文
【中图分类】R552
谷氨酰胺(glutamine，Gln)作为一种条件必需氨基酸，是肠道细胞和免疫细胞最
重要的能源物质，其在脓毒血症中的保护作用及其机制是目前的研究热点。

脓毒血症时血中Gln水平下降，补充Gln可以调节机体免疫功能，保护重要脏器，降低
感染发生率和病死率，但其具体保护机制仍不完全清楚。

目前较为流行的观点认为，其保护作用与诱导热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)有关［1，2］。

但我们前期的实验［3］发现，Gln可诱导细胞表达HSPs72，但并不足以抑制其TNF
－α释放，因此，单用诱导HSPs表达的机制并不足以解释Gln在体内保护作用，提示Gln在脓毒血症时保护机体细胞和器官功能还存在其他机制。

近年来的研究发现，创伤性休克大鼠的肠系膜淋巴液可损伤内皮细胞，抑制骨髓祖细胞的生长［4］，结扎肠系膜淋巴管可明显减轻肺部损伤［5］。

脓毒血症大鼠
肠系膜淋巴液可明显抑制胃肠道运动［6］，我们设想在脓毒血症时肠淋巴液可能也会产生某种有害物质损伤细胞。

Gln可降低肠道通透性，因此我们推测其可能藉
此作用以减少脓毒血症时肠源性毒性物质进入淋巴液，从而对机体发挥保护作用，但目前尚未见这方面的报道。

本研究旨在观察脓毒血症时肠淋巴液对巨噬细胞的功能是否存在抑制作用，单次静脉注射Gln能否减弱抑制作用，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法
1.1 主要试剂
Gln－丙氨酸(批号:0610175－01，无锡华瑞制药有限公司);胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和DMEM培养液(Gibco，美国);内毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和乳酸脱氢酶(Sigma，美国);ELISA 试剂盒(R＆D，美国);Gln检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 动物分组、模型制作与样本采集
健康SD雄性大鼠280～350 g，由复旦大学实验动物科学部提供。

动物的生产许可证号为SCXK(沪)2007－0002，使用许可证号为SYXK(沪)2006－0010。

动物适应性饲养1周后进行实验。

将大鼠随机分为假手术组(Sham)、脓毒血症组(sepsis model group，CLP)和Gln组，每组10只。

经腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)予以全身麻醉，按 Singleton等［1］报道的方法对CLP和Gln组大鼠实施盲肠结扎穿孔法复制脓毒血症模型，Sham组大鼠则仅开腹翻动盲肠。

术后即刻皮下注射生理盐水20 mL/kg补充术中液体丢失。

术后10 min内Gln组大鼠经尾静脉注射Gln 0.75 g/kg，Sham组和CLP组注射等量生理盐水。

每组中各取5只大鼠，暴露肠系膜根部，分离与肠系膜上动脉伴行的肠系膜淋巴管，行肠系膜淋巴管插管，关闭腹腔，收集术后5 h和6 h时点的淋巴液，以3 000 r/min的速度离心15 min，吸取上清液，－80℃保存备用;每组其余5只大鼠，于术后6 h 采集血样，－80℃保存。

1.3 细胞培养和分组
小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7购自中科院上海生化细胞研究所，以含2
mmol/L Gln、10，胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM
培养基在37℃、5%CO2的培养箱中常规培养。

取对数生长期RAW264.7细胞，按5×105个/孔的数量接种于24孔板，先加入含100 ng/mL LPS无血清培养液，再分别加入含有Sham组、CLP组和Gln组终浓度为20%的淋巴液共同孵育，4
h后收集各组细胞上清液，－80℃保存备用。

细胞分组命名同动物分组。

1.4 相关检测
按照Gln检测试剂盒说明书测定各组大鼠淋巴液中Gln浓度;按照ELISA检测试剂盒说明书测定各组大鼠淋巴液及RAW264.7细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor－α，TNF－α)和白介素 6(interleukin－6，IL－6)含量;根据 Richard 等［7］描述的方法检测血浆D－乳酸浓度。

1.5 统计学方法
采用SAS 8.0软件作单因素方差分析。

计量资料以表示，采用Tukey法进行两两
比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1 大鼠淋巴液和RAW264.7细胞培养上清液中TNF－α 和 IL－6 浓度的变化
各组大鼠淋巴液和RAW264.7细胞培养上清液中TNF－α和IL－6浓度的ELISA
检测结果详见表1。

统计学分析结果显示:CLP组和 Gln组淋巴液中TNF－α和 IL
－6的浓度均明显高于 Sham组(P＜0.05);CLP组与Gln组淋巴液中TNF－α和IL －6的浓度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

CLP组RAW264.7细胞培养上清液中 TNF－α浓度较 Sham组明显下降(P＜0.05)，而Gln组 RAW264.7细胞培
养上清液中TNF－α浓度显著高于CLP组(P＜0.05)，但仍明显低于Sham组(P＜0.05);CLP组与Gln组RAW264.7细胞培养上清液中IL－6浓度比较差异无统计
学意义(P＞0.05)，但均显著低于 Sham组(P＜0.05)。

2.2 大鼠淋巴液Gln浓度和血浆D－乳酸浓度的变化
统计学分析结果表明:Sham组、CLP组和Gln组淋巴液中Gln浓度在组间比较，
差异均无统计学意义(P＞0.05);CLP组血浆D－乳酸的质量浓度显著高于Gln组和Sham组(P＜0.01)，而Gln组与Sham组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(图1)。

表1 各组淋巴液和细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的质量浓度(，pg/mL)Tab 1 Concentrations of TNF-αand IL-6 in mesenteric lymph and supernatants in each group(，pg/mL)①P＜0.05与Sham组比较;②P＜0.05与CLP组比较。

图1 各组大鼠淋巴液中Gln浓度和血浆中D－乳酸的质量浓度Fig 1 Concentrations of Gln in lymph and D-lactate in plasma in e ach group①P
＜0.01与Sham组比较;②P＜0.01与CLP组比较。

3 讨论
脓毒血症时肠道通透性增加，可释放大量肠源性毒性物质及炎性因子，加剧机体的炎症反应及组织器官的损伤，然而这些肠源性毒性物质及炎性因子是通过什么途径，又是如何影响免疫细胞的功能仍不完全清楚。

TNF－α和IL－6是脓毒血症时最重要的炎性介质，可触发“级联”反应，影响其他炎性介质释放［8］。

本研究结果显示，脓毒血症大鼠淋巴液中TNF－α和IL－6含量明显升高，与创伤性休克时大鼠肠淋巴液中炎症因子浓度的变化情况类似［9］。

脓毒血症大鼠的淋巴液对RAW264.7细胞的分泌功能有明显抑制作用。

D－乳酸是细菌发酵的代谢产物，血浆中D－乳酸水平可反映肠黏膜损害程度和通透性变化状况。

本实验结果显示，
脓毒血症大鼠血浆D－乳酸水平明显升高，肠通透性增加。

因此我们考虑，脓毒
血症大鼠淋巴液的这种变化可能与肠通透性改变有关［10］。

对于Gln在脓毒血症中的作用及其机制研究很多，但有关减轻肠淋巴液毒性作用
的研究则未见报道。

本研究发现，补充Gln可明显减轻脓毒血症时淋巴液对巨噬
细胞分泌功能的抑制作用，并伴有肠通透性的明显降低。

同时我们也发现，脓毒血
症大鼠注射Gln后淋巴液中 TNF－α和IL－6浓度无明显变化，该结果提示，由淋巴液引起的RAW264.7细胞功能变化可能并非由淋巴液中炎性因子直接作用所致。

高浓度的Gln本身对细胞功能有刺激作用［3］;因此，本研究对淋巴液中的Gln浓度进行了测定，结果显示CLP组与Gln组淋巴液中Gln的浓度差异无统计学意义，提示由淋巴液引起的RAW264.7细胞功能变化可能也并非由淋巴液中Gln浓度改变所致。

有研究发现，创伤性休克大鼠的淋巴液中可能含有某些脂质［11］或某种肽［12］，从而产生细胞毒性作用，该物质可能是一种或多种肠源性毒性物质。

肠道及腹腔内容物回流有血液和淋巴两条途径，应激可导致肠屏障功能障碍，吸收的有害物质也会通过肠系膜淋巴管转运［13］。

Gln是肠道黏膜细胞和免疫细胞的主要能源物质，在创伤、感染等应激状态下补充Gln则可改善受损的肠黏膜屏障功能。

本研究发现Gln组血浆D－乳酸水平明显降低，因此我们推测Gln的此种作用可能与Gln降低肠道通透性，减少肠源性有毒物质进入淋巴液有关。

值得注意的是，我们的体外实验以巨噬细胞为靶细胞，观察肠淋巴液对巨噬细胞分泌功能的影响。

上述实验结果显示:脓毒血症大鼠补充Gln可减轻淋巴液对细胞功能的抑制作用，并不意味着该淋巴液进入体内也会促进免疫细胞分泌炎症因子。

淋巴液在体内对炎性细胞的影响尚有待进一步研究。

综上所述，脓毒血症时肠淋巴液可抑制巨噬细胞分泌功能，而Gln可部分恢复细胞功能。

这可能与Gln改善肠道通透性、减少肠淋巴液中细胞毒性物质有关;这也可能是Gln在脓毒血症中发挥全身保护作用的机制之一，该研究为深入理解Gln 保护作用及其机制提供了有益的线索。

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