抗氧化性检测（羟基自由基、普鲁士蓝）

抗氧化性检测（羟基自由基、普鲁士蓝）
d.还原能力的测定
采用普鲁士兰法。

分别精密吸取各组分浓度为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mg/mL的多糖及Vc 溶液2mL，加入0.2mol/L pH=6．6的磷酸盐缓冲液2.5mL及1%铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，于50℃水浴加热20min后迅速冷却，再加入10%三氯乙酸溶液2.5mL，混匀后吸取2.5mL 溶液于比色管中，加蒸馏水2.5mL和0.1%氯化铁溶液0.5mL，常温反应10min后于700nm 处测定吸光值，吸光值越大，表明还原能力越强。

a.清除羟基自由基活性的测定
采用水杨酸法。

在10mL试管中依次加入9mmol/LFeSO4溶液2mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL和各组分浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL的多糖或Vc溶液2mL，8.8mmol/LH2O2溶液2mL。

充分混匀后于37℃水浴30min，于510nm处测定吸光值A，以加蒸馏水为空白对照，做三次平行试验。

用以下公式计算对羟基自由基的清除率：
R=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100%(2-10)
式中，Ao表示加入蒸馏水空白体系的吸光值；
Ai表示为加入不同浓度样品溶液后测得的吸光值。

Aj表示水代替H2O2时不同多糖浓度下测得的本底吸光值。

取7支试管依次加入1.8 mmol/L FeSO4 1.0mL、1.8mmol/L水杨酸0.75 mL、0.3% H2O2 0.5mL摇匀，分别向7支试管中加入10 mg﹒L-1多糖溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL，再补水至0.5mL，摇匀，37℃水浴30 min，以双蒸水为参比测其510nm处吸光度Ax。

空白实验：0.5 mL双蒸水取代多糖溶液，重复上述过程，测吸光度A0；对照实验：用0.5 mL双蒸水取代H2O2溶液，重复上述过程，测吸光度A s；用蒸馏水分别取代多糖溶液和H2O2溶液，重复上述过程，测吸光度A s0 。

样品对羟自由基的清除率计算见式（1）。

羟自由基清除率（%）=（1-（A x-A s）/ （A0 - A s0））× 100
（1）
b.清除超氧阴离子自由基活性的测定
采用邻苯三酚自氧化法[97]。

将50mmol/LTris-HCl（pH=8.2）的缓冲液4.5ml置于25℃水浴中预热25min，依次加入各组分浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg/mL的Vc溶液1mL 或浓度为0.02，0.08，0.2，0.6，1.0mg/mL的多糖溶液，2.5mmol/L邻苯三酚溶液0.4mL。

混匀后，在4min内，于325nm处每隔30s测定溶液的吸光值，做三次平行试验。

计算邻苯三酚溶液的吸光值随时间的变化率K，以蒸馏水代替样液做空白对照，并用以下公式计算对超氧阴离子的清除率：R=[(Ko-Ki)/Ko]×100%
式中，Ko表示加入蒸馏水空白体系的邻苯三酚溶液的吸光值随时间的变化率；
Ki表示加入不同浓度样品溶液后邻苯三酚溶液的吸光值随时间的变化率。

c.清除DPPH自由基活性的测定
将各组分多糖及Vc配制成质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL的溶液。

分别准确移取2mL上述多糖或Vc溶液于比色管中，加入0.2mmol/L的DPPH-乙醇溶液2mL，混匀后在室温下于暗处静置30min。

用60%乙醇溶液调零，在517nn处测定溶液的吸光值。

做三次平行试验。

用以下公式计算对DPPH的清除率：R=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100%
式中，Ao为60%乙醇代替样品溶液时测得的吸光值；Ai为加入不同浓度样品溶液后测得的吸光值；Aj为60%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液时测得的样品本底吸光值
e清除ABTS自由基活性的测定
参照Ru等（2012）的方法：将ABTS（7 mmol﹒L-1，5 mL）和过硫酸钾溶液（140 mmol﹒L-1，88 μL）混合，室温避光反应12 h，制备ABTS自由基储备液。

使用前用乙醇将储备液稀释至其在734 nm处吸光值为0.70±0.02的ABTS 工作液。

取5支试管依次加入25mg﹒mL-1多糖溶液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mL，再补水
至0.05mL，再分别加入3.0mL ABTS工作液，摇匀静置30min，以无水乙醇为参比在734nm波长下测定其吸光度。

空白实验：0.05 mL双蒸水取代多糖溶液，重复上述过程，测吸光度A0；对照实验：用3.0 mL无水乙醇取代ABTS 工作液，重复上述过程，测吸光度A s；同时用0.05 mL双蒸水取代多糖溶液，3.0 mL无水乙醇取代ABTS工作液，重复上述过程，测吸光度A s0。

样品对ABTS 自由基的清除率计算见式（2）
ABTS自由基清除率（%）=（1-（A x-A s）/ （A0 - A s0））× 100 （2）。