赣南“纽荷尔”脐橙叶精油成分分析

㊃生命科学与生物技术㊃
赣南 纽荷尔 脐橙叶精油成分分析
*
陈 琳,刘 可,孙靖宇,林小财,钟八莲,淳 炯†
(赣南师范大学生命科学学院;国家脐橙工程技术研究中心,江西赣州 341000
)摘 要:以赣南 纽荷尔 脐橙健康及感染黄龙病的新叶和老叶为材料,采用同时蒸馏萃取法提取叶精油,应用
气相色谱-质谱联用技术(G C -M S )对精油成分进行分析鉴定,通过峰面积归一化法计算各成分相对含量,比较不同叶片精油成分及含量的差异.橙叶精油中共鉴定出48种化合物,主要成分包含桧烯㊁3-蒈烯㊁月桂烯㊁柠檬烯㊁β-罗勒烯㊁芳樟醇㊁松油烯-4-醇㊁橙花醛㊁香叶醛等.结果表明,不同生长时期的叶片精油在成分组成及含量上有一定差异性,并且感染黄龙病的叶片与健康叶片相比,精油的某些成分及含量发生了变化,这些差异性可能是影响黄龙病传播媒介-柑橘木虱取食和产卵行为的重要因素.关键词:赣南脐橙;同时蒸馏萃取;叶精油;G C -M S
;成分分析中图分类号:S 666.4 文献标志码:A 文章编号:2096-7659(2021)06-0078-05
植物精油是植物次生代谢产生的挥发性有机化合物,主要由单萜烯烃类,倍半萜烯烃类和醇㊁醛㊁酮㊁酯
类等含氧衍生物组成[1].据研究报道,柑橘精油具有赋香调味㊁抑菌消炎㊁抗氧化㊁抗癌等作用,在医药㊁农药㊁食品等领域有广泛的应用.国内外学者对柑橘果皮精油香气成分[2]进行了大量的研究,而对柑橘叶精油的研
究非常有限.赣南是中国最大的脐橙产业基地,除橙皮外,橙叶也是提取精油的原材料,叶精油中含有柠檬
烯㊁芳樟醇㊁柠檬醛等成分可开发利用[3].
此外,柑橘叶片作为与环境密切联系的器官,其精油化学成分与柑橘病虫害有密切联系.万珊等人[4]研究表明柑橘叶片的挥发性气味对柑橘粉虱的寄主选择有重要影响,另有
研究表明柑橘木虱(柑橘黄龙病的传播媒介)偏好在芸香科植物新梢上取食产卵,新叶的精油成分对柑橘木
虱有引诱作用[5].C a o 等人[6]采用气相色谱-
离子迁移谱分析了健康和感染黄龙病的橙叶和柚叶的挥发性有机化合物,发现一些化合物对于健康和染病叶展现出明显不同的信号强度,可以用于预测黄龙病的感染情
况.本论文采用同时蒸馏萃取法提取赣南脐橙健康和感染黄龙病的新叶与老叶精油,分析精油成分及其含量的差异性,可为脐橙资源的综合利用提供参考,有助于开发新型的木虱引诱剂,探索防治柑橘黄龙病及其它病虫害的新策略.
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
材料:实验材料采至赣南师范大学种质资源圃及周围的 纽荷尔 脐橙果园,分别从感染黄龙病果树和未感染黄龙病果树上采集春梢新叶(新发出的幼嫩叶片)和越冬老叶(上年留下的叶片).新叶抽发整齐且数量多,叶片较小,呈长椭圆形.老叶叶色浓㊁叶质粗硬,叶片较大.采摘时间为2017年4月,当时树龄为14年.
试剂:分析纯石油醚(30ħ~60ħ)和分析纯氯化钠,购于天津市大茂化学试剂厂;分析纯无水硫酸钠购于天津市鼎盛鑫化工有限公司;蒸馏水,自制;C 7-C 30正构烷烃标样购于美国S u p
e l c o 公司.仪器:98-1-B 型电子调温电热套,天津市泰斯特仪器有限公司;同时蒸馏萃取装置;L S -2500型低温恒温
槽,南京新辰生物科技有限公司;R E -52C 型旋转蒸发仪,上海恬恒仪器有限公司;S H B -I I I 型循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;B -220恒温水浴锅,上海兹讯仪器有限公司;D C -2006低温恒温槽,开封市宏兴科教仪器厂;S H I MA D Z U G C M S -Q P 2010S E 气相色谱-质谱联用仪,日本岛津公司.2021年 赣南师范大学学报 ɴ.6第六期 J o u r n a l o f G a n n a n N o r m a l U n i v e r s i t y
N o v .2021*收稿日期:2021-07-24 D O I :10.13698/j
.c n k i .c n 36-1346/c .2021.06.016 基金项目:江西省教育厅科学技术项目青年项目(G J J 170848);江西省高等学校科技落地计划项目(K J L D 14079
) 作者简介:陈琳(1984-)
,女,江西赣州人,赣南师范大学生命科学学院讲师,博士,研究方向:柑橘资源综合利用. †通讯作者:
淳炯,赣南师范大学生命科学学院教授,博士,研究方向:柑橘资源综合利用.
1.2 方法
1.2.1 聚合酶链反应(P C R )
检测脐橙叶片黄龙病脐橙叶片黄龙病的检测完全参照高玉霞等[7]
的方法,主要步骤包括: 提取叶片总D N A ; 选取引物;
P C R 扩增反应; 进行琼脂糖凝胶电泳,
染色等.通过观察扩增条带判断检测结果.1.2.2 同时蒸馏萃取法(S D E )
提取脐橙叶片精油采集新鲜叶片洗净㊁阴干后切碎,称取100g
,置于2000m L 蒸馏烧瓶中,再分别加入1000m L 蒸馏水和10g 氯化钠.
300m L 石油醚(沸程30ħ~60ħ)作为萃取溶剂加入另一500m L 蒸馏烧瓶中.将装有物料和萃取溶剂的烧瓶分别接在同时萃取仪的两端,用电加热套进行加热蒸馏,通过控制加热速度使两边溶剂沸腾,水蒸气和溶剂蒸气缓慢上升到蒸馏器顶部汇合,同时在仪器中被冷凝下来,蒸馏时间为3h .收集混合液,于分液漏斗中静置分层,分离出有机相,无水硫酸钠干燥,过滤,再用旋转蒸发仪在水泵减压的条件下于30ħ~35ħ的水浴中旋蒸除去溶剂,得到淡黄色透明液体.产率为0.15%.1.2.3 G C -M S 分析
色谱条件 色谱柱:S H -R x i -5S i l M s 石英毛细管柱(30.00mˑ0.25mmˑ0.25μm )
;升温程序:起始柱温60ħ,以5ħ升温速率升至200ħ;再以30ħ升温速率升至240ħ,保持6m i n ;进样口温度250ħ;载气为氦气,吹扫流量3.0m L /m i n ;压力60k P a ;精油样品未加任何溶剂,用针头手动进样,进样量1.0μL ;
分流比50ʒ1.
质谱条件 离子源为E I ;能量70e V ;质量扫描范围35m /z ~500m /z ;离子源温度200ħ;接口温度280ħ;溶剂延迟时间2.5m i n .
1.2.4 成分结构鉴定
叶片精油成分经气相色谱分离,形成不同的色谱峰,以C 7-C 30正构烷烃为标准,
根据总离子图谱中各峰保留时间计算样品中化合物保留指数,利用N I S T 图谱库检索及参考相关文献[8]确定精油成分,
用峰面积归一法计算精油成分的相对含量,用E x c e l 处理数据.
图1 健康新叶精油总离子图 图2
健康老叶精油总离子图
图3 感染黄龙病新叶精油总离子图 图4 感染黄龙病老叶精油总离子图
2 结果与分析
应用G C -M S 对健康和感染黄龙病(H L B )的赣南 纽荷尔 脐橙新叶
及老叶精油进行检测及成分鉴定,用峰面积归一法计算各成分的相对含量.4种不同叶片精油的成分及含量见表1,共鉴定出
48种化合物,包含11种单萜烯㊁8种倍半萜烯㊁12种醇㊁6种醛㊁4种酯等,其中健康新叶
和H L B 新叶中分别鉴定出41㊁39种成分,总含量分别为91.87%㊁90.05%;健康老叶和H L B 老叶精油分别鉴定出44㊁42种成分,总含量分别为96.32%㊁92.32%.4种叶片精油的总离子图如图1-4所示,图中对不同叶片精油中相对含量最高的15种化合物进行了标记,
标记号码与表1中的峰号一致.9
7第6期 陈 琳,刘 可,孙靖宇,等 赣南 纽荷尔 脐橙叶精油成分分析
表1 健康及感染黄龙病的新老叶片精油成分及含量
峰
号保留
指数保留指数
(文献)
化合物
分子式相对含量/%
健康新叶 健康老叶 黄龙病新叶 黄龙病老叶
1849858(Z )-3-己烯-1-醇C 6H 12O
-0.10--2927927α-侧柏烯C 10H 160.200.230.240.32
3936929α-蒎烯C 10H 160.700.840.910.674979970
桧烯C 10H 169.5910.1310.957.855983980β
-蒎烯C 10H 161.111.081.241.126992991
月桂烯C 10H 162.022.982.262.537101510093-蒈烯C 10H 163.006.122.875.39810201020α-萜品烯C 10H 161.240.761.391.27910271027p
-伞花烃C 10H 140.170.470.410.471010321030
柠檬烯C 10H 162.288.413.266.501110501052顺式-β
-罗勒烯C 10H 164.257.554.757.121210611061γ-萜品烯C 10H 162.131.372.582.061310721073顺式-水合桧烯C 10H 18O 0.280.340.250.331410871088
萜品油烯C 10H 161.331.611.321.401511041102
芳樟醇C 10H 18O 13.513.3912.337.461611271122反式-对-薄荷-2,8-二烯-1-醇C 10H 16O 0.480.240.440.551711391139反式-柠檬烯氧化物C 10H 16O 0.090.070.030.231811451145顺式-对-薄荷-2,8-二烯-1-醇C 10H 16O 0.23-0.21-1911571155
香茅醛C 10H 18O 1.748.651.159.732011861178松油烯-4-醇C 10H 18O 7.113.186.587.992111981191α-松油醇C 10H 18O 2.230.331.720.652212061205
癸醛C 10H 20O -0.08-0.13
2312111220(Z )-薄荷烯醇C 10H 18O 0.440.080.12-2412301231
香茅醇C 10H 20O -4.39-2.342512501243
橙花醛C 10H 16O 6.412.403.254.012612511253
香叶醇C 10H 18O 0.931.36--2712721272
香叶醛C 10H 16O 6.003.204.106.272812931295
百里香酚C 10H 14O 0.180.07-0.1629131313232-甲氧基-4-乙烯基苯酚C 9H 10O 20.670.960.32-3013211321
香叶酸甲酯C 11H 18O 2-0.520.172.233113521358
乙酸香茅酯C 12H 22O 2-4.05-1.61
3213621366
乙酸橙花酯C 12H 20O 2-3.37-1.45
3313821382
乙酸香叶酯C 12H 20O 2-2.97-2.10
3413951395β
-榄香烯C 15H 246.844.839.632.593514241424β
-石竹烯C 15H 242.701.723.281.233614301431γ-榄香烯C 15H 240.45-0.120.033714531450β
-金合欢烯C 15H 242.450.362.190.193814591459α-石竹烯C 15H 241.490.901.540.643914911480β
-芹子烯C 15H 240.740.160.330.104014961499α-芹子烯C 15H 240.43-0.530.144115041504α-金合欢烯C 15H 240.490.230.610.094215491549
榄香醇C 15H 26O 0.100.11--4315541564反式-橙花叔醇C 15H 26O 0.19-0.150.0744********
石竹烯氧化物C 15H 24O 0.170.190.170.254516961700β
-甜橙醛C 15H 22O 3.792.563.971.044617501756α-甜橙醛C 15H 22O 0.890.801.140.704719641969
棕榈酸C 16H 32O 20.840.181.870.794821132122
植醇C 20H 40O
1.98
2.981.670.52
"-"表示未检测到
2.1 健康新叶精油与健康老叶精油中各成分含量比较
由表1和图5可知,健康新叶精油的萜烯类物质(单萜烯+倍半萜烯43.44%)含量低于健康老叶(49.28%),其中新叶精油单萜物质含量(27.85%)低于老叶(41.08%),而倍半萜物质含量(15.59%)高于老叶(8.20%).由表1和图6可知,老叶精油中含量高于新叶的单萜化合物包括3-蒈烯(老叶6.12%,
新叶3.00%)㊁柠檬烯(老叶8.41%,新叶2.28%)㊁顺式-β
-罗勒烯(老叶7.55%,新叶4.25%)等;含量低于新叶的倍半萜类化合物包括β-榄香烯(老叶4.83%,新叶6.84%)㊁β-石竹烯(老叶1.72%,新叶2.70%)㊁β
-金合欢烯(老叶0.36%,新叶2.45%)
等.由表1和图7可看出,部分醇类和醛类物质在健康新叶和老叶精油中含量0
8赣南师范大学学报 2021年
呈现出较大的差异性:芳樟醇(新叶13.51%,老叶3.39%)㊁松油烯-4-醇(新叶7.11%,老叶3.18%)㊁香茅醛(新叶1.74%,老叶8.65%)㊁橙花醛(新叶6.41%,老叶2.40%)㊁香叶醛(新叶6.00%,老叶3.20%).此外,老叶精油中还包括4种酯类物质:香叶酸甲酯㊁乙酸香茅酯㊁乙酸橙花酯和乙酸香叶酯,而新叶精油中未检测到这类化合物
.
图5
脐橙不同叶片精油主要成分含量
图6 脐橙叶片精油中几种主要萜烯化合物的
含量比较
图7 叶片精油中几种主要醇类和醛类化合物的
含量比较
2.2 感染黄龙病新叶与老叶精油成分比较
由表1和图5㊁图6可知,感染黄龙病的新叶精油中
萜烯类物质含量(50.00%)高于感病老叶(41.24%),其中含量差异性较大的成分包括桧烯(新叶10.95%,
老叶7.85%)㊁3-蒈烯(新叶2.87%,老叶5.39%)㊁柠檬烯(新叶3.26%,老叶6.50%)㊁顺式-β
-罗勒烯(新叶4.75%,老叶7.12%)㊁β
-榄香烯(新叶9.63%,老叶2.59%)和β-石竹烯(新叶3.28%,老叶1.23%)
等.由表1和图5㊁图7可知,感病新叶精油中醇类物质总含量(23.47%)高于老叶(19.91%),而醛类物质总含量(13.61%)低于老叶(21.88%),其中含量差异性较大的成分包括芳樟醇(新叶12.33%,老叶7.46%)㊁香茅醛(新叶1.15%,老叶9.73%)㊁香叶醛(新叶4.10%,老叶6.27%)等.感病老叶精油中检测出香叶酸甲酯㊁乙酸香茅酯㊁乙酸橙花酯和
乙酸香叶酯4种酯类物质,而感病新叶精油中只检测到香叶酸甲酯一种酯类物质.
2.3 健康叶片精油与感病叶片精油各成分含量比较
健康新叶精油中萜烯类物质总含量(43.44%)比感病新叶(50.00%)低,其中含量差异性较大的包括桧烯(健康9.59%,感病10.95%)㊁柠檬烯(健康2.28%,感病3.26%)和β-榄香烯(健康6.84%,感病9.63%).健康老叶精油萜烯类物质总含量(49.28%)高于感病老叶(41.24%),主要表现在桧烯(健康10.13%,感病
7.85%)㊁柠檬烯(健康8.41%,感病6.50%)㊁β
-榄香烯(健康4.83%,感病2.59%)等单体成分的含量中.感病叶片精油与健康叶片精油中醇㊁醛类物质含量的主要变化:感病新叶精油中芳樟醇㊁松油烯-4-醇㊁香茅醛㊁橙花醛㊁香叶醛的含量均低于健康新叶,而感病老叶精油中上述成分含量均高于健康老叶(如图7).此外,感病老叶精油中酯类物质总含量(7.39%)
低于健康老叶精油(10.91%),单体成分包括香叶酸甲酯(感病2.23%,健康0.52%)㊁乙酸香茅酯(感病1.61%,健康4.05%)㊁乙酸橙花酯(感病1.45%,健康3.37%)和乙酸香叶酯(感病2.10%,健康2.97%).
3 结论与讨论
上述分析表明,4种不同叶片精油成分中含量最高是萜烯类物质(41.24%~50.00%),其次是醇类(16.50%~27.48%)㊁醛类(13.61%~21.88%)等物质.赣南 纽荷尔 脐橙叶精油中萜烯类物质主要包括桧烯㊁3-蒈烯㊁柠檬烯㊁β-罗勒烯㊁β-榄香烯等;醇类主要包括芳樟醇㊁松油烯-4醇㊁α-松油醇㊁香茅醇等物质;醛类物质主要包括香茅醛㊁橙花醛㊁香叶醛㊁甜橙醛等物质;而酯类物质(包括乙酸香茅酯㊁乙酸橙花酯㊁乙酸香叶
酯等)主要存在脐橙老叶精油中.林正奎等[9
]报道了宜昌橙叶精油的主要成分包括柠檬烯(15.674%)
㊁罗勒烯(37.844%)㊁芳樟醇(7.464%)等,马蜂橙叶精油的主要成分包括香茅醇(77.934%)㊁芳樟醇(3.592%)
㊁乙酸香茅酯(2.201%)
等[10
],精油成分与本研究结果大致相同,而成分的含量有较大的差异性,这说明了不同品种橙叶精油成分的组成及含量有较大差异.此外,本研究结果证明健康新叶与老叶㊁以及感染黄龙病的脐
橙叶片与未感病的健康叶片中精油的物质成分及相对含量均存在较大的差异性.
1
8第6期 陈 琳,刘 可,孙靖宇,等 赣南 纽荷尔 脐橙叶精油成分分析
28赣南师范大学学报2021年有研究报道植物精油对柑橘害虫有引诱或驱避作用[11].柑橘叶片的挥发性气味会影响亚洲柑橘木虱(柑橘黄龙病的传播媒介)的行为选择,尤其是对某些萜烯类和醛类物质(包括桧烯㊁橙花醛㊁罗勒烯㊁香茅醛)
有较强烈的嗅觉反应[12].G C-M S结果显示桧烯㊁柠檬烯㊁罗勒烯㊁芳樟醇㊁香茅醛㊁松油烯-4-醇㊁橙花醛等是赣南 纽荷尔 脐橙叶片精油中的主要成分,且这些化合物的含量在不同叶片精油中有较大差异.健康老叶精油中桧烯㊁罗勒烯和香茅醛的含量高于健康新叶,而橙花醛含量低于新叶,这几种物质含量的差异可能是影响柑橘木虱在新叶上取食产卵的重要因素.此外,感染黄龙病叶片精油中某些化合物,包括3-蒈烯,柠檬烯㊁罗勒烯㊁柠檬醛㊁香茅醛等的相对含量发生了较大的变化,与相关研究报道可能影响木虱行为选择的挥发性物质[13]大致相同,这说明了柑橘叶片中的挥发性物质确实与木虱的侵染有密切联系.
本研究分析了赣南 纽荷尔 脐橙感染黄龙病及健康新叶和老叶精油成分及含量的变化,有助于进一步深入研究影响柑橘木虱取食产卵行为选择的挥发性化合物,对柑橘病虫害的防控及植物源农药的开发提供了参考,对脐橙资源的综合利用也有积极意义.
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G a n n a n"N e w h a l l"N a v e l O r a n g e
C H E N L i n,L I U K e,S U N J i n g y u,L I N X i a o c a i,Z H O N G B a l i a n,C HU N J i o n g
(S c h o o l o f L i f e S c i e n c e,N a t i o n a l N a v e l O r a n g e E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t e r,
G a n n a n N o r m a l U n i v e r s i t y,G a n z h o u341000,C h i n a)
A b s t r a c t:T h e n e w a n d o l d l e a v e s o f t h e G a n n a n"N e w h a l l"n a v e l o r a n g e,w h i c h w e r e h e a l t h y o r i n f e c t e d w i t h H u a n g l o n g-b i n g(H L B),w e r e u s e d a s m a t e r i a l s t o e x t r a c t l e a f e s s e n t i a l o i l s b y s i m u l t a n e o u s d i s t i l l a t i o n e x t r a c t i o n m e t h o d.G a s c h r o m a-t o g r a p h y a n d m a s s s p e c t r o m e t r y(G C-M S)t e c h n i q u e w a s u s e d t o a n a l y z e a n d i d e n t i f y e s s e n t i a l o i l c o m p o n e n t s.T h e r e l a t i v e c o n t e n t o f e a c h c o m p o n e n t w a s c a l c u l a t e d t h r o u g h t h e p e a k a r e a n o r m a l i z a t i o n m e t h o d,a n d t h e d i f f e r e n c e s i n t h e c o m p o n e n t s a n d c o n t e n t o f e s s e n t i a l o i l s i n d i f f e r e n t l e a v e s w e r e c o m p a r e d.A t o t a l o f48c o m p o u n d s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n o r a n g e l e a f e s-s e n t i a l o i l,a n d t h e m a i n c o m p o n e n t s i n c l u d e d s a b i n e n e,3-c a r e n e,m y r c e n e,l i m o n e n e,β-o c i m e n e,l i n a l o o l,t e r p i n e n-4-o l,n e r-a l,a n d g e r a n i a l,e t c.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e c e r t a i n d i f f e r e n c e s i n t h e c o m p o s i t i o n a n d c o n t e n t o f e s s e n t i a l o i l s i n l e a v e s a t d i f f e r e n t g r o w t h s t a g e s,a n d c o m p a r e d w i t h h e a l t h y l e a v e s,c e r t a i n c o m p o n e n t s a n d c o n t e n t s o f e s s e n t i a l o i l s i n l e a v e s i n f e c t e d w i t h H u a n g l o n g b i n g h a v e c h a n g e d.T h e s e d i f f e r e n c e s m i g h t a f f e c t t h e f e e d i n g a n d o v i p o s i t i o n b e h a v i o r o f c i t r u s p s y l-l i d,t h e H u a n g l o n g b i n g v e c t o r.
K e y w o r d s:G a n n a n n a v e l o r a n g e;s i m u l t a n e o u s d i s t i l l a t i o n e x t r a c t i o n;l e a f e s s e n t i a l o i l;G C-M S;c o m p o n e n t a n a l y s i s。