台盼蓝染色鉴定拟南芥sdl1突变体的细胞死亡

DOI： 10. 3969 / j. issn. 1001-5280. 2013. 03. 02
Identification of Cell Death of Arabidopsis Thaliana Mutant sdl1 by Trypan Blue Staining
ZHI Tian-tian1 ，ZHOU Zhou1 ，HAN Cheng-yun1 ，ＲEN Chun-mei1，2*
台盼蓝染液配方： 2. 5 g 台盼蓝溶于 1 mL 乳酚 ﹝ 25% 乳酸（ 质量体积比） ，23% 水溶苯酚，25% 甘 油，其余是无菌水﹞。
2 结果与分析
2. 1 sdl1 突变体的表型
突变体 sdl1 从第 6 天开始，小苗叶片出现先萎 蔫、后白化现象，第 7 天可看到突变体 sdl1 小苗叶片 出现全绿、半萎蔫半绿、半绿半白、全白 4 种情况，并 且停止生长，到第 8 天几乎所有突变体 sdl1 小苗的 叶片全部白化。
1. 3 染色方法
野生型拟南芥叶片和突变体拟南芥叶片浸泡在 台盼蓝染液中，沸水浴染色 2 min，自然冷却后室温 染色过夜，后于 1. 25 g / mL（ 250 g 水合氯醛用 40 mL 蒸馏水溶解，定容至 200 mL） 或 1. 12 g / mL （ 224 g 水合氯醛用 40 mL 蒸馏水溶解，定容至 200 mL） 水 合氯醛脱色 3 d，每天换一次脱色液。体视显微镜观 察细胞死亡情况并拍照记录。
细胞死亡在植物生长发育和抵抗逆境方面具有 重要意义： 在细胞水平上，细胞死亡是维持细胞数量 平衡的重要手段； 在发育中，细胞死亡有形态建成和 去除无用组织细胞的作用，而且还是抵御病原物入 侵和环境 胁 迫 的 重 要 机 制 之 一［1］。 植 物 在 遇 到 环 境胁迫如病害、高盐、水涝和低温时，某些部位需要 发生细胞死亡来度过不良环境，这是植物在进化过 程 中 自 身 形 成 的 对 环 境 的 适 应 能 力。台 盼 蓝 （ Trypan blue） 或称台盼兰、锥虫蓝、曲利苯蓝，是一 种高 分 子 量 的 活 性 染 色 剂，分 子 量： 960. 8 OD［2］。 它是细胞活性染料，常用于检测细胞死亡。细胞死
（ 1 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China； 2 Key Laboratory of Crop Gene Engineering of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China）
表 1 不同天数突变体 sdl1 小苗叶片白化率比较
处理后 天数 6 7 8
完全 绿色株
212 57 43
部分 白化株
91 74 34
完全 白化株
393 565 619
完全白化率 （ %） 56. 5% 81. 2% 88. 9%
注： 部分萎蔫的苗统计到部分白化苗中。
2. 3 野生型 Col － 0 及突变体 sdl1 的台盼蓝染色
的拟南芥野生型小苗子叶a突变体sdl1白化小苗子叶b以及萎蔫小苗子叶c的台盼蓝染色结果结论拟南芥野生型col和突变体sdl1直接铺种于ms1sucrose培养基上在光照周期为16光照条件下生长到第6天突变体sdl1叶片开始出现部分萎蔫和白化随着天数的增加植株叶片白化率不断升高生长8后几乎所有突变体叶片全部变白而野生型正常
亡检测 被 广 泛 应 用 于 多 个 科 研 领 域，如 药 物 筛 选［3］、细胞增殖测定［4］、药物毒性测定［5］、肿瘤药敏 实验［6］等。目 前 最 常 用 的 检 测 细 胞 死 亡 的 方 法 是 台盼蓝染色法。
本实验以模式植物拟南芥为材料，采用台盼蓝染 色的方法对细胞死亡进行检测，旨在确证突变体 sdl1 细胞死亡的发生，为进一步研究突变体 sdl1 奠定基础。
智能人工气候箱： PＲX － 450B； 体视显微镜： Nikon C － DS。
1. 2 培养方法
用消毒液（ 20% bleach + 0. 1% Triton100） 将 Col － 0 野生型及 sdl1 突变体种子浸泡 8 ～ 10 min 后，用无 菌水清洗 3 ～ 4 次，铺种在含 1% 蔗糖的 MS 培养基 上，4℃ 下春化 3 d 后转入设定光周期为 16 h 黑暗 / 8 h光照的人工气候箱生长 5 ～ 8 d，培养温度 22 ± 2℃ ，光照强度 80 ～ 120 μmol / m2 ·s，相对湿度 65% 。
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CＲOP ＲESEAＲCH
2013，27（ 3）
（ Col － 0） 及突变体 sdl1，由本实验室提供； 台盼蓝，L － 乳酸： Amresco 公司； 苯酚： 北京索莱宝科技有限 公司； 甘油： 天津市恒兴化学试剂有限公司（ A. Ｒ. ） ； 水合氯醛： 国药集团化学试剂有限公司（ A. Ｒ. ） ； 琼 脂粉和蔗糖购自市场。
对生长 7 d 的野生型 Col － 0 和突变体 sdl1 小 苗进行台盼蓝染色，并在体视显微镜下观察，发现只 有突变体半萎蔫半绿小苗子叶萎蔫处出现蓝色沉 淀，完全白化小苗和野生型小苗没有（ 图 1） 。
图 1 生长 7 d 的拟南芥野生型小苗子叶（ A） 、突变体 sdl1 白化小苗子叶（ B） 以及萎蔫小苗子叶（ C） 的台盼蓝染色结果
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作物研究
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台盼蓝染色鉴定拟南芥 sdl1 突变体的细胞死亡
支添添1 ，周 舟1 ，韩成云1 ，任春梅1，2*
（ 1 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128； 2 作物基因工程湖突变体 sdl1 在光周期为 16 h 黑暗 /8 h 光照条件下生长叶片出现先萎蔫后白化现象，采用台盼蓝
2. 2 不同天数突变体 sdl1 叶片白化率统计比较
分别将第 6 天、第 7 天、第 8 天叶片出现部分萎 蔫、部分白化和完全白化的突变体 sdl1 株数进行统 计。统计结果显示随着天数的增加，突变体 sdl1 小 苗完全白化率随之增加，而全绿和部分白化的比率 随之减少，说明随着天数的增加，突变体 sdl1 叶片 白化的速度加快（ 表 1） 。
3 结论
拟南芥野生型 Col － 0 和突变体 sdl1 直接铺种 于 MS + 1% sucrose 培养基上，在光照周期为 16 h 黑 暗 /8 h 光照条件下生长到第 6 天，突变体 sdl1 叶片
开始出现部分萎蔫和白化，随着天数的增加植株叶 片白化率不断升高，生长 8 ～ 9 d 后几乎所有突变体 叶片全部变白，而野生型正常。经台盼蓝染色证实 突变体 sdl1 发生细胞死亡，但完全死亡（ 完全白化）
参考文献：
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染色的方法研究萎蔫及白化苗的死亡情况，结果证实突变体 sdl1 萎蔫处发生细胞死亡，但细胞完全死亡（ 完全白
化） 后不能被染色，所以台盼蓝染色只能对突变体 sdl1 细胞死亡的早期进行鉴定。
关键词： 拟南芥； 台盼蓝染色； 细胞死亡
中图分类号： Q813. 4
文献标识码： A
文章编号： 1001-5280（ 2013） 03-0217-02
1 材料与方法
1. 1 试验材料、试剂与仪器 拟南 芥 （ Arabidopsis thaliana） 野 生 型 Columbia
收稿日期： 2013 -02 -24 作者简介： 支添添（ 1988 － ） ，女，湖南岳阳人，硕士研究生，Email： 69913891@ qq. com。* 通信作者。 基金项目： 国家自然科学基金项目（ 30671121） 。
Abstract： Phenomenon of leaves wilting and albinism of the Arabidopsis thaliana Mutant sdl1 seedlings was observed when grew for 5 － 8 days under 16 hours dark / 8 hours light condition. The death status was studied by Trypan blue staining， and the results showed that sdl1 leaves couldn’t be stained when totally whitened，so Trypan blue staining could identify sdl1 cell death just in the early stage of cell death. Key words： Arabidopsis thaliana； Trypan blue staining； Cell death
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( 上接第 218 页) 后不能被染色，所以台盼蓝染色只能对突变体 sdl1 细胞死亡的早期进行鉴定。野生型不能被染色是因 为没有发生细胞死亡，白化部分猜测是由于细胞完 全死亡，DNA 降解，不能与台盼蓝结合形成蓝色沉 淀，因而不能被染色。
参考文献：
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( 下转第 223 页)
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合速率的增加是胞间 CO2 浓度增加的结果，而营养 生长期Ⅱ到营养生长期Ⅲ期间，净光合速率降低是 气孔导度降低引起胞间 CO2 浓度降低的结果，所以 营养生长期间，光照强烈，叶片净光合速率主要受气 孔因素的影响； 生长后期，净光合速率随胞间 CO2 浓度增高而降低，表现出负相关，说明净光合速率降 低不是因为胞间 CO2 供应不足，可能与光照强度以 及叶肉细胞的羧化活性降低有关［7］。整个生育期， 蒸腾速率的大小在一定程度上取决于气孔导度的大 小，叶片气孔开放从而导致其蒸腾速率加快，两者呈 正相关关 系，这 与 玉 米 的 研 究 结 果 相 一 致［8，9］。 多 数研究表明，植物净光合速率的日变化呈双峰曲线， 有“光合 午 休 ”现 象［10］，而 且 植 株 不 同 部 位 不 同 叶 片的光合速率不同［11］，可在后续试验中对其展开相 关研究，以找到最能够代表南荻同源四倍体光合速 率的参考值。