血管内皮生长因子抑制剂生物学活性检测方法的建立

基预稀释 rhVEGF121 至 1. 25 nmol ／ L，再以含 0. 1% FBS 的 Opti-MEMⅠ培养基进行 2. 5 倍稀释，共 6 个 稀释度，每一稀释度设 2 个复孔；将稀释好的 rhVEGF121 加入已接种 293 细胞的培养板内，10 μl ／ 孔，混合， 置 37℃，5% CO2 条件下培养 5 ～ 7 h，室温条件下平 衡至少 10 min；加入荧光素酶底物溶液，100 μl ／ 孔， 混合后在室温条件下反应 30 ～ 70 min，用 Spectra Max Gemini XS 酶标仪在细胞培养板上读取相对光 单位（Relative light units，RLU）数值。 1. 5 VEGF Trap 的生物学活性检测
采用荧光素酶报告基因检测系统，取对数生长 期的 293 细胞，经胰蛋白酶消化后，以含 0. 1% FBS 的 Opti-MEMⅠ培养基重悬细胞，调整细胞浓度至 1. 25 × 105 个 ／ ml，接种于白色底部不透明的 96 孔 细胞培养板中，每孔 80 μl，37℃，5% CO2 条件下培 养 15 ～ 20 h；以含 0. 1% FBS 的 Opti-MEMⅠ培养
【关键词】 血管内皮生长因子抑制剂；生物学活性；荧光素酶检测系统
Development of A Method for Determination of Biological Activity of Vascular Endothelial Growth Factor Trap
WANG Lan, RAO Chun-ming, LI Yong-hong, et al（National Institute for the Control of Pharmaceutical and Bio－ logical Products, Beijing 100050, China）
中国生物制品学杂志 2009 年 9 月第 22 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2009，Vol. 22 No. 9 中国图书分类号 ［R34］ 文献标识码 A 文章编号 1004-5503（2009）09-0895-04
血管内皮生长因子抑制剂பைடு நூலகம்物学活性检测方法的建立
铺板过程同 1. 4 项。次日，用含 0. 1% FBS 的 Opti-MEM Ⅰ 培 养 基 配 制 浓 度 为 200 pmol ／ L 的 rhVEGF121 溶液备用。以含 0. 1% FBS 的 Opti-MEMⅠ 培 养 基 将 VEGF Trap 参 考 品 和 供 试 品 预 稀 释 至 5 nmol ／ L，分别于 96 孔板上进行倍比稀释，共 8 个 稀释度，每一稀释度设 2 个复孔；将稀释好的参考品 和供试品加入已接种 293 细胞的细胞培养板内， 10 μl ／ 孔，再加入上述制备的 200 pmol ／ L rhVEGF121 溶液 10 μl，得到 rhVEGF121 最终浓度为 20 pmol ／ L （最终每孔体积为 100 μl），混合后置 37℃，5% CO2 条件下培养 5 ～ 7 h，检测过程同上。 1. 6 结果计算
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中国生物制品学杂志 2009 年 9 月第 22 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2009，Vol. 22 No. 9
称为 Flt-1）胞外区分别与 IL-18 受体 α（IL-18Rα）和 IL-18 受体 β（IL-18β）胞内区融合而成。VEGFR1 与 VEGF 结合后发生二聚化，使得 IL-18Rα 和 IL-18β 胞内结构域相互作用，并传递信号，引起 NFκB 荧光 素酶报告基因活化［11］（图 1）。选择两种方法分离上 述 293 细胞：①在与各嵌合受体相关的选择标记 （G418 和潮霉素）中培养转染的细胞，以确保 2 个嵌 合受体的存在；②通过 VEGF 刺激细胞，用流式细胞 术（FACS）分离具有强 NFκB 启动子的 GFP 细胞，再 进一步筛选引入 VEGF 时 GFP 高表达、不存在 VEGF 时 GFP 低表达的细胞，最后分离克隆并扩增细胞 系，用于生物学活性测定。
王兰 饶春明 李永红 高凯 王军志
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【 摘要 】 目的 建立血管内皮生长因子抑制剂（VEGF Trap）生物学活性检测方法。方法 利用 HEK293 ／ D9 ／ Flt-18R（al－
pha）／ Flt-IL18R（beta），clone V3H9 细胞系，通过荧光素酶检测系统（Steady-Glo誖Luciferase Assay system）进行 VEGF Trap 的生
图 1 荧光素酶生物学活性检测示意图 Fig 1. Sketch map of luciferase assay
1. 2 供试品 rhVEGF121 购自 R&D 公司；VEGF Trap 参考品、
3 批 VEGF Trap 原液及 6 批成品均由 Regeneron 公 司提供。 1. 3 主要试剂及仪器
利用 SOFT MAX 软件分析实验数据，以 VEGF Trap 浓度为 x 轴，对应的平均 RLU 值为 y 轴，选用 的回归模型为四参数方程，绘制每个活力测定板的 VEGF Trap 参考品和供试品剂量反应曲线。根据各 供试品的半数抑制浓度（IC50），按照以下公式计算 效价。
胎牛血清（FBS）、无血清 DMEM 培养液、OptiMEMⅠ培养液、青 霉 素（10 000 U ／ ml）& 链 霉 素 （10 000 mg ／ ml）溶液、胰蛋白酶-EDTA 和 MEM 非 必需氨基酸溶液（NEAA）均购自 GIBCO 公司；G418 硫 酸 盐 和 潮 霉 素 B 溶 液 均 购 自 Mediatech 公 司 ； Steady-Glo誖Luciferase Assay system 为 Promega 公司 产品；Spectra Max Gemini XS 多功能酶标仪及 SOFT MAX 分析软件为美国 Molecular Devices 公司产品。 1. 4 VEGF 剂量反应曲线的绘制
【Key words】 Vascular endothelial growth factor（VEGF）Trap; Biological activity; Luciferase assay system
血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制剂（VEGF Trap）是一种由人 VEGF 受体胞外区序列与人 IgG1 Fc 段融合形成的重组蛋 白［1］。在多项抗肿瘤试验中发现，VEGF Trap 可以 有效阻断新生血管的形成，从而使肿瘤组织由于缺 乏血管的营养补给而不能正常生长［2，3］。VEGF Trap 还可阻断除肿瘤外的其他疾病的病理性血管生长， 如糖尿病性视网膜病、银屑病以及由移植、感染或创 伤引起的病理性角膜血管形成［4～8］。目前，VEGF Trap 在国外尚处于临床观察阶段，全球均未上市［9］。但 该类产品的临床、流行病学以及实验研究数据，为其 发展成为一种治疗多种新生血管疾病的药物提供了
基金项目：国家高技术研究发展计划（2007AA021601）. 作者单位：中国药品生物制品检定所重组技术产品室 （北京
100050）. 通讯作者：王军志，E-mail：wangjz@
有力的理论依据。Ⅰ期和Ⅱ期临床观察的初步结果 已证明了该药的有效性、安全性和可靠性［10］。
为了对此类药物进行有效的质量控制，首先需 要建立准确可靠的生物学活性测定方法。本文以荧 光素酶报告基因检测系统为平台，利用改造后的 293 细胞系，建立了灵敏、快速的 VEGF Trap 生物学活 性检测方法。
1. 材料与方法 1. 1 细胞系
HEK293 ／ D9 ／ Flt-18R（alpha）／ Flt-IL18R（beta）， clone V3H9 细胞系（简称 293 细胞）由 Regeneron 制 药公司提供。该 293 细胞是原代人胚肾细胞转染 5 型 腺 病 毒（Ad 5）DNA 的 永 生 化 细 胞 ，稳 定 转 染 NFκB-荧光素酶-IRES-eGFP 质粒和 2 个嵌合受体基 因。这 2 个嵌合受体是将 VEGF 受体 1（VEGFR1，也
物学活性检测，用 VEGF Trap 参考品计算供试品的相对百分效价，并对该方法进行精密性和准确性验证。结果 VEGF Trap 供 试品及参考品在该方法中均存在量效关系，且符合四参数方程式：y =（A - D） ／ ［1 +（X ／ C）B］+ D。3 批 VEGF Trap 原液和 6 批 成品经 3 次测定，相对百分效价的平均值在（90. 00 ± 2. 40）% ～（116. 77 ± 16. 50）%之间，变异系数均小于 15%。1 批 VEGF Trap 原液及成品经 3 次测定，回收率分别为（90. 40 ± 2. 67）%和（117. 20 ± 18. 12）%。结论 已成功建立 VEGF Trap 生物学活性检测 方法，该方法重复性好，准确性高，可作为 VEGF Trap 生物学活性的常规检测方法。
【Abstract】 O bjective To develop a method for determination of biological activity of vascular endothelial growth factor （VEGF） Trap. Methods The biological activity of VEGF Trap was determined by Steady-Glo 誖 Luciferase Assay System using HEK293 ／ D9 ／ Flt-18R （alpha）／ Flt-IL18R （beta）, clone V3H9 cell line, and relative percent potency was calculated. The developed method was verified for precision and accuracy. Results Either test sample or reference of VEGF Trap showed a dose-response mode by the developed method, and the determination result complied with the following four-parameter equation: y =（A - D）／［1 +（X ／ C）B］+ D. Three batches of bulks and six batches of final products of VEGF Trap were determined for 3 times, and the result showed mean rela － tive percent potencies of（90. 00 ± 2. 40）% ~（116. 77 ± 16. 50）%, with a variation coefficient of less than 15%. One batch of bulk and one batch of final product were determined for 3 times, and the result showed recovery rates of （90. 40 ± 2. 67）% and （117. 20 ± 18. 12）% respectively. Conclusion A method for determination of biological activity of VEGF Trap was successfully developed, which showed good reproducibility and high accuracy and might be used routinely.